L去离子水中，配制成质量浓度为0.1%均一蛋白及多糖贮液，分别调节pH至7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中缓慢加入v/v 6.67%聚阴离子多糖溶液，磁力搅拌，调节pH至4.5,4000rpm离心20min，收集沉淀；对上清液再次重复沉淀I次，合并沉淀物，即得大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物。
[0016]将得到的大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物悬浮于2-3倍体积的去离子水中，调节pH至7.5，过截留分子量为10kD的超滤膜除糖，收集滤过液；截留分子量3000超滤脱盐，即得纯化的大豆凝集素。称取纯化的大豆凝集素1.0mg，溶解于1.0mL超纯水中，配制成浓度为1.0mg/mL的溶液，过0.45 μ m微孔滤膜，SEC-HPLC检测蛋白纯度，并做SDS-PAGE电泳分析。
[0017]经测定，以上实例所得大豆凝集素，约含有蛋白94.9 %，总糖1.3%，灰分1.8%及水分 2.0%。
[0018]实施例2
将大豆乳清调至pH 4.7,9500rpm离心30min，除沉淀；再次调至pH 8.5,9500rpm离心30min，弃沉淀，收集上清液。将上述上清液调节pH至4.5，量取2L溶液，在4_30°C下按照硫酸钱饱和度表加入固体硫酸钱至50%饱和度，9500rpm离心30min，收集沉淀，上清液继续添加硫酸铵至70%饱和度，再次9500rpm离心30min，收集沉淀，合并两次沉淀，得到含有的大豆凝集素蛋白粗品约1.85g，加入30mL去离子水溶解，截留分子量3500透析脱盐48小时，截留液真空冷冻干燥，制得含有大豆凝集素和β -淀粉酶的P-7S蛋白样品。
[0019]分别精确称取0.3g上述初级分离的P-7S蛋白样品及0.3g聚阴离子多糖粉末，分别溶解于10mL去离子水中，配制成质量浓度为0.3%均一蛋白及多糖贮液，分别调节pH至7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中缓慢加入v/v 5.0%聚阴离子多糖溶液，磁力搅拌，调节pH至4.7,4000rpm离心20min，收集沉淀；对上清液再次重复沉淀I次，合并沉淀物，即得大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物。
[0020]将得到的大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物悬浮于2-3倍体积的去离子水中，调节pH至8.5，过截留分子量为200kD的超滤膜除糖，收集滤过液；截留分子量3500超滤脱盐，即得纯化的大豆凝集素。称取纯化的大豆凝集素2.0mg，溶解于1.0mL超纯水中，配制成浓度为2.0mg/mL的溶液，过0.45 μ m微孔滤膜，SEC-HPLC检测蛋白纯度，并做SDS-PAGE电泳分析。
[0021]经测定，以上实例所得大豆凝集素，约含有蛋白95.5 %，总糖1.1%，灰分1.8%及水分 1.6 %o
[0022]实施例3
将大豆乳清调至pH 4.8,9500rpm离心30min，除沉淀；再次调至pH 9.0,9500rpm离心30min，弃沉淀，收集上清液。将上述上清液调节pH至4.7，量取1.5L溶液，在4_30°C下按照硫酸钱饱和度表加入固体硫酸钱至50%饱和度，9500rpm离心30min，收集沉淀，上清液继续添加硫酸铵至80%饱和度，再次9500rpm离心30min，收集沉淀，合并两次沉淀，得到含有大豆凝集素蛋白粗品约1.57g，加入30mL去离子水溶解，截留分子量3500透析脱盐48小时，真空冷冻干燥，制得含有大豆凝集素和β -淀粉酶的P-7S蛋白样品。
[0023]分别精确称取0.4g上述初级分离的P-7S蛋白样品及0.4g聚阴离子多糖粉末，分别溶解于10mL去离子水中，配制成质量浓度为0.4%均一蛋白及多糖贮液，分别调节pH至7.0。向上述大豆乳清蛋白溶液中缓慢加入v/v 3.3%聚阴离子多糖溶液，磁力搅拌，调节pH至5.0，4000rpm离心20min，收集沉淀；对上清液再次重复I次，合并沉淀物，即得大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物。
[0024]将得到的大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物悬浮于2-3倍体积的去离子水中，调节pH至8.0，过截留分子量为300kD的超滤膜除糖，收集滤过液；截留分子量4000超滤脱盐，即得纯化的大豆凝集素。称取纯化的大豆凝集素3.0mg，溶解于1.0mL超纯水中，配制成浓度为3.0mg/mL的溶液，过0.45 μ m微孔滤膜，SEC-HPLC检测蛋白纯度，并做SDS-PAGE电泳分析。
[0025]经测定，以上实例所得大豆凝集素，约含有蛋白95.2 %，总糖1.8%，灰分1.6 %及水分1.4 %。
【主权项】
1.一种从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于步骤如下: (1)大豆乳清的预处理:将大豆乳清调至pH4.5-4.8，9500rpm离心30min，除沉淀；再次调至pH 8.0-10.0，9500rpm离心30min，收集上清液，即得大豆乳清液； 用pH调节剂调节pH ； (2)大豆乳清蛋白的初级分离:取步骤(I)所得大豆乳清液，调节pH至4.5，在4-30°C下加入硫酸钱至终饱和度为50%，9500rpm离心30min，收集沉淀，继续向上清中添加硫酸钱至饱和度60%-80%，9500rpm离心30min，收集沉淀；合并两次沉淀，加入去离子水溶解，使沉淀的质量浓度为1%_10%，截留分子量3500透析脱盐36-72h，截留液用真空冷冻干燥仪进行干燥，制得含有大豆凝集素和β -淀粉酶的P-7S蛋白； (3)大豆乳清蛋白与聚阴离子多糖复凝聚:将步骤(2)制备的P-7S蛋白，用去离子水配制终浓度为0.1%-0.4%的P-7S大豆乳清蛋白液，调节pH至7.0，待用；配制0.1%_0.4%的聚阴离子多糖溶液，调节PH至7.0 ;向P-7S大豆乳清蛋白液中缓慢加入按P-7S大豆乳清蛋白液体积计2.5%-8%的聚阴离子多糖溶液，调节pH至5.0-4.5，4000rpm离心20min，收集沉淀；对上清液再次重复沉淀I次，合并沉淀物，即得大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物； (4)回收大豆凝集素:将步骤(3)所得大豆凝集素与聚阴离子多糖的复合物悬浮于2-3倍体积的去离子水中，调节pH至7.0-9.0，过超滤膜除糖，收集滤过液；截留分子量3000-4000超滤脱盐，截留液用真空冷冻干燥仪进行干燥，即得纯化的大豆凝集素。
2.根据权利要求1所述的从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于:所述聚阴离子多糖包括但不限于卡拉胶，硫酸酯化半乳聚糖及硫酸酯化多糖，阿拉伯胶，海藻酸钠或果胶；其相对分子量范围为300-2000kD。
3.根据权利要求1所述的从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于步骤(I)所述大豆乳清的来源:收集常规的大豆分离蛋白生产形成的副产物或实验室利用脱脂豆柏经醇洗后，提取分离蛋白后所得的大豆蛋白乳清液，进行预处理。
4.根据权利要求3所述的从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于大豆乳清的预处理步骤为:首先将大豆蛋白乳清液调节PH至4.5-4.8，静止l-2d，离心，除杂蛋白完全，再调节至pH 8.0-10.0，9500rpm离心30min，收集上清液，即得大豆乳清液。
5.根据权利要求1所述的从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于:步骤(4)中超滤膜除糖截留分子量范为100-300kD ;脱盐处理包括但不限于透析，超滤，纳滤，需保证脱盐完全。
6.根据权利要求1所述的从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，其特征在于:所述PH调节剂为:调节酸性:有机酸:包括但不限于甲酸、乙酸；无机酸:包括但不限于盐酸，硫酸；优先选择无机酸；调节碱性:包括但不限于氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸氢钠，优先选择氢氧化钠。
【专利摘要】本发明涉及一种从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法，属于农产品加工及副产品综合利用领域。本发明方法包括以下步骤：（1）大豆乳清的预处理；（2）大豆乳清蛋白的初级分离；（3）大豆乳清蛋白与聚阴离子多糖复凝聚；（4）回收大豆凝集素。原料经预处理、初级分离后复凝聚得到终蛋白多糖复合物；所得终蛋白多糖复合物经超滤除糖，二次离心后即得含有纯化大豆凝集素的蛋白溶液，该蛋白溶液经过真空冷冻干燥得到大豆凝集素高纯度样品。本发明对大豆乳清综合利用，设备要求低，操作简单，无环境污染。且大豆凝集素回收率高，纯度高，蛋白活性高，仍然保持天然的生理活性。
【IPC分类】C07K14-42, C07K1-34
【公开号】CN104530207
【申请号】CN201410786151
【发明人】华欲飞, 李兴飞, 孔祥珍, 张彩猛, 陈业明
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月18日