亲和力成熟的CRIg变体的制作方法
【专利说明】亲和力成熟的CRIg变体
[0001] 本申请是申请日为2009年05月06日、中国申请号为200980116490. 9、发明名称 为"亲和力成熟的CRIg变体"的发明申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明关注亲和力成熟的CRIg变体。具体而目，本发明关注具有提尚的对C3b的 结合亲和力且保留胜过C3的对C3b的选择性结合的CRIg变体。
[0003] 发明背景
[0004] 补体系统
[0005] 补体系统是由正常情况下以无活性的酶原形式存在的一系列血清糖蛋白构成的 复杂酶级联。三种主要途径，即经典、旁路和甘露糖结合凝集素途径，能活化补体，它们在C3 水平合并，其中两种类似的C3转化酶将C3切割成C3a和C3b。
[0006] 巨噬细胞是已经发展出如下先天能力的专门细胞，即识别细胞表面表达的鉴定标 签的结构中的微小差异，所述的鉴定标签即所谓的分子样式（Taylor等，EurJImmunol 33,2090-1097(2003)Jaylor等，AnnuRevImmunol23,901-944(2005))。虽然这些 表面结构的直接识别是先天免疫的一个基础方面，但是调理作用容许通用巨噬细胞受体 介导吞食，提高效率和使吞细胞的识别全集多样化（Stuart和Ezekowitz,Immunity 22, 539-550 (2005))。吞食过程涉及多种配体-受体相互作用，而且现在清楚了多种 调理素（包括免疫球蛋白、胶原凝集素、和补体成分）经由与巨噬细胞表面受体的相 互作用来引导病原体内在化所需要的细胞活性（综述见Aderem和Underhi11，Annu RevImmunoll7，593-623 (1999);Underhill和Ozinsky，AnnuRevImmunol 20, 825-852(2002))。虽然由种系基因编码的天然免疫球蛋白能识别极其多种病原体，但是 大多数调理性IgG是经由适应性免疫生成的，而且因此经由Fc受体的高效清除不是立即的 (Carroll,NatImmunol5,981-986(2004))。另一方面，补体快速识别病原体表面分子并使 微粒准备好由补体受体来摄取（Brown,InfectAgentsDis1,63-70(1991))。
[0007] 补体由30种以上的血清蛋白质组成，它们调理极其多种病原体，用以被补体受 体所识别。取决于级联的初始触发，可区别三种途径（综述见Walport,NEnglJMed 344, 1058-1066 (2001))。所有这三种途径共享活化中枢成分C3的共同步骤，但是它们依据 识别的本质和导致C3活化的初始生化步骤而不同。经典途径如下活化，抗体结合至病原体 表面，其继而结合Clq补体成分，引起一系列蛋白酶级联，最终将C3切割成其活性形式C3b。 凝集素途径在碳水化合物基序受到凝集素蛋白质识别后被活化。至今，已经鉴定了此途径 的三个成员：结合甘露糖的凝集素（MBL) ,SIGN-Rl凝集素家族和ficolin(Pyz等，AnnMed 38, 242-251 (2006))。MBL和ficolin都与丝氨酸蛋白酶有关，其像经典途径中的Cl那样 起作用，活化成分C2和C4,导致中枢C3步骤。旁路条件与经典条件和凝集素途径二者形 成对照，即它是由于内部C3酯与病原体表面上的识别基序的直接反应而被活化的。经由旁 路途径蛋白酶因子B和因子D的作用，初始C3结合活化性表面导致C3b沉积的快速扩大。 重要的是，经由因子B和D的作用，通过经典途径或凝集素途径任一所沉积的C3b也能导致 C3b沉积的扩大。在补体活化的所有三种途径中，调理中的关键步骤是成分C3转化成C3b。 补体级联的酶对C3的切割将硫酯暴露于亲核攻击，容许C3b经由硫酯结构域共价附着到抗 原表面上。这是补体调理中的初始步骤。对所结合的C3b的后续蛋白水解生成iC3b、C3c 和C3dg，即受到不同受体识别的片段（Ross和Medof,AdvImmunol37,217-267(1985))。 此切割消除了C3b进一步扩大C3b沉积和活化补体级联晚期成分（包括能够指导膜破坏 的膜攻击复合物）的能力。然而，巨噬细胞的吞噬细胞受体优先识别C3b及其片段；由于 醋键形成的通用性，C3介导的调理对于病原体识别是重要的（Holers等，ImmunolToday 13, 231-236 (1992))，而且各种C3降解产物的受体因此在宿主免疫应答中发挥重要作用。
[0008]C3自身是由13个独特结构域组成的复杂的且有柔性的蛋白质。该分子的核心由 8个所谓的巨球蛋白（MG)结构域构成，它们构成了C3的紧密压缩的a和0链。插入此 结构的是CUB(Clr/Cls、Uegf?和骨形态生成蛋白-1)和TED结构域，后者含有容许C3b与病 原体表面共价结合的硫酯键。剩余结构域含有C3a，或者作为核心结构域的接头和间隔物 起作用。C3b和C3c结构与C3的比较证明了该分子在每次蛋白水解时经历重大构象重排， 不仅暴露TED，而且暴露了该分子的能与细胞受体相互作用的别的新的表面（Janssen和 Gros,MolTmmun〇1 44, 3-10 (2007))〇
[0009] 吞噬细朐h的补体C3#体
[0010] 有三个已知的补体受体基因超家族：短共有重复（SCR)模块（其编码CRl和CR2)， 0-2整联蛋白家族成员CR3和CR4,及免疫球蛋白Ig超家族成员CRIg。
[0011] CRl是由30个短共有重复（SCR)组成的180-210kDa糖蛋白，在免疫复合物清 除中发挥主要作用。SCR是约60个氨基酸的模块结构，每个有两对二硫键，提供结构刚 性。对C3b和C4b二者的高亲和力结合经由两个独特位点发生，每个由3个SCR构成 (综述见Krych-Goldberg和Atkinson,ImmunolRev180, 112-122 (2001))。CRl的SCR 15-17内所包含的C3b结合位点（位点2)的结构已经通过MRI测定（Smith等，Cel1 108, 769-780 (2002))，揭示了三个模块处于延伸的头对尾排列中，在16-17连接处有柔性。 结构指导的诱变鉴定了模块15上对C4b结合至关重要的一个带正电荷的表面区域。此片与 CRl同一面上暴露的模块16的碱性侧链一起是C3b结合所需要的。CRl的主要功能，首先描 述为免疫粘附受体（Rothman等，JImmunol115, 1312-1315(1975))，用以捕捉红细胞上的 1C，供转运和通过肝的清除（Taylor等，ClinImmunolImmunopathol82, 49-59 (1997)) 〇 嗜中性细胞上的CRl在吞噬中有作用，但是在组织巨噬细胞中不然（Sengelov等，J Immunol153,804-810(1994))。在其在免疫复合物清除中的作用之外，经由其与相应转 化酶的相互作用，CRl是经典途径和旁路途径二者活化的有力抑制剂（Krych-Goldberg和 Atkinson, 2001，见上文；Krych-Goldberg等，JBiolChem274,31160-31168(1999))。在 小鼠中，CRl和CR2是同一基因通过可变剪接形成的两种产物，主要与B淋巴细胞和滤泡树 突细胞有关，且主要在调节B细胞应答中发挥功能（Molina等，1996)。CRl的小鼠功能等 效物Crry灭活经典途径和旁路途径酶，并作为补体活化的内在调控物起作用，而不是作为 吞噬细胞受体起作用（Molina等，ProcNatlAcadSciUSA93,3357-3361 (1992))。
[0012] CR2(⑶21)结合iC3b和C3dg，而且是增强B细胞免疫的主要补体受 体（Carroll,NatImmunol5,981-986 (2004);Weis等，ProcNatlAcadSciUSA 81，881-885 (1984))。关联B细胞对C3d包被的抗原的摄取经由B细胞抗原受体导致增强 的信号。如此，CD21-CD19-CD81共同受体与B细胞抗原受体的共参与降低了B细胞活化的 阈值并提供了重要的存活信号（Matsumoto等，JExpMed173,55-64(1991))。iC3b上的 CR2结合位点已经部分定位在介于TED和MGl结构域之间的界面上（Clemenza和Isenman,J Immunol165, 3839-3848(2000))。
[0013] 〇?3和〇?4是由€1亚基（分别为〇)1113或€^和〇)11( ；或（1){)和共同0链（〇)18 或0 2)构成的跨膜异二聚体，而且涉及对胞外基质和对其它细胞的粘附以及iC3b识别。它 们属于整联蛋白家族，而且不仅在吞噬中，而且在白细胞运输、突触形成和共刺激中实施功 能（综述见Ross，AdvImmunol37, 217-267(2000))。整联蛋白粘性经由称作内向外信号传 导的过程来调控，将整联蛋白自低亲和力结合状态转化成高亲和力结合状态（Liddington 和Ginsberg,JCellBiol158, 833-839(2002))。另外，配体结合将信号自胞外结构域转导 至胞质。iC3b的结合位点已经定位至CR3和CR4的a链上的数个结构域（Diamond等，J CellBiol120,1031-1043(1993);Li和Zhang,JBiolChem278,34395-34402(2003); Xiong和Zhang,JBiolChem278,34395-34402(2001))。CR3 的多种配体（iC3b、￠-葡 聚糖和ICAM-1)似乎结合⑶Ilb的I结构域内所包含的部分交叠位点（Balsam等，1998 ; Diamond等，1990 ;Zhang和Plow, 1996)。基于将CR3结合位点定位至在C3b中CUB结构域 解折叠后变成暴露的残基的结构研宄，预测了它对蛋白水解灭活形式的C3b(即iC3b)的特 异性识别（Nishida等，ProcNatlAcadSciUSA103, 19737-19742(2006))，这发生在补 体调控蛋白酶因子I的a'链切割后。
[0014]CRIg是一种巨噬细胞相关受体，与A33抗原和自血流清除病原体所需要的JAMl 有同源性。人CRIg蛋白是使用识别人JAMl的保守Ig结构域的简并引物首先自人胎cDNA 文库克隆的。对数个克隆的测序揭示了 400个氨基酸的可读框。Blast搜索证实了与1型 跨膜蛋白Z39Ig的相似性（Langnaese等，BiochimBiophysActa1492(2000)522-525)。 发现此分子的胞外区有两个Ig样结构域组成，包含N端V-set结构域和C端C2_set结构 域。这种新的人蛋白质最初称作"单次跨膜Ig超家族成员巨噬细胞相关的"（huSTIgM)。 (huSTIgM)。随后，使用3'和5'引物，克隆了huSTIgM的一种剪接变体，它缺少最接近膜的 IgC结构域，而且短50个氨基酸。因而，这种人蛋白质的较短剪接变体称作huSTIgMA-短。 huSTIgMA(称作PR0362)的氨基酸序列和编码多核苷酸序列披露于2002年6月25日授权 的美国专利No. 6, 410, 708。另外，huSTIgMA和huSTIgMA-短二者以及鼠STIgMA(muSTIgMA) 蛋白质和核酸序列披露于2004年4月15日公布的PCT公开文本WO2004031105。
[0015] 2008年2月21日公布的美国申请公开文本No. 2008/0045697中披露了CRIg和 C3b:CRIg复合物的晶体结构。
[0016] 驻留在肝血窦的内腔内的Kupffer细胞（KC)形成身体中最大群的巨噬细胞。虽然 KC具有与其它组织驻留的巨噬细胞共同的标志物，但是它们实施专门化的功能，连接通向 有效清除自消化道的微血管系统排出的门静脉血中存在的、肠衍生的细菌、微生物碎片、细 菌内毒素、免疫复合物和死细胞（Bilzer等，LiverInt26,1175-1186(2006))。病原体对 KC表面的有效结合是针对病原体的一线免疫防御中的一个至关重要的步骤（Benacerraf 等，JExpMed110, 27-48(1959))。消减了KC的小鼠中显著升高的死亡率证明了KC在自循 环中快速清除病原体方面的重要作用（Hirakata等，InfectImmun59,289-294(1991))。 CRIg的鉴定进一步强调补体和KC在针对循环中的病原体的一线免疫防御中的重要作用。
[0017] 在小鼠KC上鉴定的唯一补体C3受体是CRIg和CR3(Helmy等，Cell 124, 915-927 (2006))，而人KC显示额外的CRl和CR4 表达（Hinglais等，1989)。在 体外，KC上的CRIg和CR3都有助于对iC3b调理的微粒的结合（Helmy等，LabInvest 61，509-514(2006))。在体内，KC表达的CR3在结合iC3b包被的病原体中的作用不太清 楚。已经提出，CR3有助于经嗜中性细胞募集和与嗜中性细胞表达的ICAMl的相互作用 而间接清除病原体（Conlan和North,ExpMed179,259-268(1994);Ebe等，PatholInt 49,519-532(1999);Gregory等，JImmunol157,2514-2520(1996);Gregory和Wing，J LeukocBiol72,239-248 (2002);Rogers和Unanue,InfectImmun61, 5090-5096 (1993))〇 相反，CRIg通过捕捉穿过肝血窦内腔的病原体而实施直接作用（Helmy等，2006,见上文）。 CRIg与CR3在结合特征中的差异部分反映了这两种受体在生物学中的差异。在KC上表达 的CRIg组成性地结合单体C3片段，而CR3只结合iC3b调理的微粒（Helmy等，2006,见上 文）。CRIg有效捕捉单体C3b和iC3b以及C3b/iC3b包被的微粒的能力反映了通过在巨噬 细胞的膜延伸的尖端处集中的CRIg分子（Helmy等，2006,见上文）与病原体表面上存在 的C3b和iC3b多聚体之间的多价相互作用而创建的升高的亲合力。虽然CR3只结合iC3b 包被的微粒，但是CRIg另外结合C3b，即在血清调理的病原体上形成的第一C3切割产物 (Croize等，InfectImmun61,5134-5139(1993))。既然结合至病原体表面的大量C3b分 子受到保护免于因子H和I的切割（Gordon等，JInfectDis157, 697-704 (1988))，那么 CRIg对C3b配体的识别确保了快速结合和清除。如此，虽然CRIg和CR3都在KC上表达，但 是它们显示不同的配体特异性、独特的结合特性和独特的病原体清除动力学。
[0018] 利用细胞表面受体来实现细胞进入的病原体的例子是病毒，像人免疫缺陷病 毒（HIV)和细胞内细菌，像结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosum)、麻风分枝 杆菌（Mycobacteriumleprae)、假结核耶尔森氏菌（Yersiniapseudotuberculosis)、 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium)和单核细胞增生利斯特氏菌（Listeria Monocytogenes)，及寄生虫，像类前气门（prostigmatoid)硕大利什曼原虫（Leishmania major)(Cossart和Sansonetti，Science304:242-248 (2004) ;Galan，Cell 103:363-366(2000);Hornef等，Nat.Immunol. 3:1033-1040 (2002);Stoiber等，]?〇1. Immunol. 42:153-160(2005))〇
[0019] 如上文所讨论的，CRIg是一种最近发现的在一个驻留组织的巨噬细胞亚群上表达 的补体C3受体。在发挥C3蛋白质的补体受体的功能之外，通过结合C3b及抑制C3和C5 的蛋白水解活化，CRIg的胞外IgV结构域选择性抑制补体的旁路途径。然而，CRIg对转化 酶亚基C3b的结合亲和力较低（IC5(I>1yM)，需要相对较高浓度的蛋白质来达到接近完全补 体抑制。因而，需要具有改善的治疗功效的CRIg多肽。本发明提供此类多肽。
[0020] 发明概述
[0021] 本发明（至少部分地）基于具有增强的结合亲和力的CRIg变体的构建。带有组 合氨基酸替代Q64R和M86Y的CRIg-ECD蛋白显示出比野生型CRIg变体提高30倍的结合 亲和力和改善7倍的补体抑制活性。另外，在小鼠关节炎模型中用亲和力改善的CRIg融合 蛋白处理导致临床得分与用野生型CRIg蛋白质处理相比显著降低。
[0022] 因而，本发明关注CRIg变体。
[0023] 一方面，本发明关注一种CRIg变体，其包含在选自下组的区域中的氨基酸替代： SEQIDN0:2 之氨基酸序列的E8-K15,R41-T47,S54-Q64,E85-Q99 和Q105-K111。
[0024] 在一个实施方案中，所述变体或其片段选择性结合C3b胜过C3。
[0025] 在另一个实施方案中，所述变体具有提高的对C3b的结合亲和力胜过SEQIDNO: 2 之天然序列人CRIg，其中所述结合亲和力可以例如提高至少2倍，或至少3倍，或至少4倍， 或至少5倍，或至少6倍，或至少7倍，或至少9倍，或至少10倍，或至少15倍，或至少20 倍，或至少30倍，或至少40倍，或至少50倍，或至少70倍，或至少80倍，或至少90倍，或 至少100倍。
[0026] 在还有一个实施方案中，所述变体是比SEQIDN0:2之天然序列人CRIg更有力的 芳路补体途径抑制剂。
[0027] 在又一个实施方案中，所述变体包含在选自下组的一个或多个氨基酸位置处的氨 基酸替代：SEQIDNO: 2之氨基酸序列中的位置8,14,18,42,44,45,60,64,86,99,105和 IlO0
[0028] 在还有一个实施方案中，所述变体包含在SEQIDNO:2之氨基酸序列中的氨基酸 位置60,64,86,99,105和110中一个或多个位置处的氨基酸替代。
[0029] 在另一个实施方案中，所述变体包含选自下组的一处或多处替代：E8W，W14F， E84Y/W14F；P45F；G42D/D44H/P45F；Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；M86ff,M86F,M86W/Q9R； M86F/Q99R;K110D，KllN;Q105R/K110N;Q105R/K110Q和Q105K/K110D。
[0030] 在另一个实施方案中，所述变体包含选自下组的一处或多处替代：Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/ Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K1ION；Q60I/Q105R/K1ION； M86Y/E8Y;M86Y/G42D/D44H/P45F;M86Y/P45F;M