86Y/G42D/D44H/P45F和M86Y/Q99K/M86Y/ Q99R/M86Y/Q105R/M86Y/Q105K/M86Y/Q105R/K110N。
[0031] 在还有一个实施方案中，所述变体包含选自下组的一处或多处替代：Q60I;Q64R; Q60I/Q64R；M86Y；Q99L；Q105K/K110D；E8ff/Q105R/Kl10N；Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y； Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/ Q64R/Q105R;Q60I/Q64R/Q105K;Q60I/Q64R/K110N;M86Y/P45F和M86Y/Q105K。
[0032] 在一个更具体的实施方案中，所述变体包含Q60I/Q64R/M86Y或Q60I/Q64R/G42D/ D44H/P45F替代。
[0033] 另一方面，本发明关注一种嵌合分子，其包含上文定义的CRIg变体。
[0034] 在一个实施方案中，所述嵌合分子是免疫粘附素。
[0035] 在另一个实施方案中，所述免疫粘附素包含比SEQIDNO:2之全长CRIg短的CRIg 变体。
[0036] 在还有一个实施方案中，所述嵌合分子包含CRIg胞外结构域。
[0037] 又一方面，本发明关注一种药物组合物，其包含与药学可接受赋形剂混合的本发 明CRIg变体或嵌合分子，例如免疫粘附素。
[0038] 还有一方面，本发明关注一种用于预防或治疗补体相关疾病或状况的方法，包括 对需要此类处理的受试者施用预防或治疗有效量的CRIg变体或包含此类变体的嵌合分 子，诸如免疫粘附素。
[0039] 在一个实施方案中，所述补体相关疾病是炎性疾病或自身免疫性疾病。
[0040] 在另一个实施方案中，所述补体相关疾病选自下组：类风湿性关节炎（RA)，成人 呼吸窘迫综合征（ARDS)，缺血和再灌注后远端组织损伤，心肺旁路手术期间补体活化，皮肌 炎，天疱疮，狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎，心肺旁路，心脏停搏诱导的冠状内皮功 能障碍，II型膜性增生性肾小球肾炎，IgA肾病，急性肾衰竭，冷球蛋白血症，抗磷脂综合 征，年龄相关黄斑变性，葡萄膜炎，糖尿病视网膜病，同种异基因移植，超急性排斥反应，血 液透析，慢性阻塞性肺窘迫综合征（COPD)，哮喘，吸入性肺炎，荨麻瘆，慢性特发性荨麻瘆， 溶血性尿毒症综合征，子宫内膜异位症，心源性休克，缺血再灌注损伤和多发性硬化（MS)。
[0041] 在还有一个实施方案中，所述补体相关疾病选自下组：炎性肠病（IBD)，系统性红 斑狼疮，类风湿性关节炎，青少年慢性关节炎，脊椎关节病，系统性硬化（硬皮病），特发性 炎性肌病（皮肌炎，多肌炎），斯耶格伦氏综合征，系统性血管炎，结节病，自身免疫性溶血 性贫血（免疫性全血细胞减少，阵发性睡眠性血红蛋白尿），自身免疫性血小板减少（特发 性血小板减少性紫癜，免疫介导的血小板减少），甲状腺炎（格雷夫斯氏病，桥本氏甲状腺 炎，青少年淋巴细胞性甲状腺炎，萎缩性甲状腺炎），糖尿病，免疫介导的肾病（肾小球肾 炎，小管间质性肾炎），中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化，特发性多神经病， 肝胆病诸如传染性肝炎（甲型，乙型，丙型，丁型，戊型和其它非亲肝性病毒的肝炎），自身 免疫性慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎，炎性和纤维 化肺病（例如囊性纤维化病），麸胶敏感性肠病，惠普尔氏病，自身免疫或免疫介导皮肤病 包括大疱性皮肤病，多形性红斑和接触性皮炎，银肩病，肺的变应性疾病诸如嗜曙红细胞性 肺炎，特发性肺纤维化和超敏感性肺炎，移植相关疾病包括移植物排斥，移植物抗宿主病， 阿尔茨海默氏病，阵发性睡眠性血红蛋白尿，遗传性血管水肿，动脉粥样硬化和II型膜性 增生性肾小球肾炎。
[0042] 在一个优选的实施方案中，所述补体相关疾病是类风湿性关节炎（RA)。
[0043] 在另一个优选的实施方案中，所述补体相关疾病是补体相关眼状况。
[0044] 在又一个实施方案中，所述补体相关眼状况选自下组：所有阶段的年龄相关黄斑 变性（AMD)，葡萄膜炎，糖尿病性和其它缺血相关视网膜病，眼内炎和其它眼内新血管疾病。
[0045] 在还有一个实施方案中，所述眼内新血管疾病选自下组：糖尿病黄斑水肿，病理性 近视，vonHippel-Lindau病，眼的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉阻塞（CRVO)，角膜新生血 管形成和视网膜新生血管形成。
[0046] 在还有一个实施方案中，所述补体相关眼状况选自下组：年龄相关黄斑变性 (AMD)，脉络膜新生血管形成（CNV)，糖尿病视网膜病（DR)和眼内炎，其中AMD包括湿性和干 性或萎缩性AMD。
[0047] 在一个实施方案中，所述患者是哺乳动物，优选人。
[0048] 另一方面，本发明关注一种用于在哺乳动物中抑制C3b变体片段生成的方法，包 括对所述哺乳动物施用有效量的本发明CRIg变体或包含此类变体的免疫粘附素。
[0049] 还有一方面，本发明关注一种用于在哺乳动物中选择性抑制旁路补体途径的方 法，包括对所述哺乳动物施用有效量的本发明CRIg变体或包含此类变体的免疫粘附素。
[0050] 附图简述
[0051] 图1A-1B显示了 399个氨基酸的全长形式的天然人CRIg(huCRIg)的核苷酸和氨 基酸序列（分别是SEQIDNO: 1和2)。
[0052] 图2A-2B显示了 305个氨基酸的短形式的天然人CRIg(huCRIg-短）的核苷酸和 氨基酸序列（分别是SEQIDNO:3和4)。
[0053] 图3A-3C显示了280个氨基酸的天然鼠CRIg(muCRIg)的核苷酸和氨基酸序列（分 别是SEQIDNO:5和6)。
[0054] 图4 :CRIg突变体在结合测定法和抑制测定法中的活性。作为C3b的竞争性置换 测量CRIg的结合亲和力（A)，而通过溶血抑制测定法测量生物学活性。PUR10680是野生型 对照（红色），RIL41 (蓝色）和RL41 (绿色）是两种突变体（B)。（C)CRIg结合界面的逐 步优化。
[0055] 图5 :竞争性ELISA与溶血测定法之间的相关性。
[0056] 图6:CRIg突变体Q64R/M86Y通过Biacore分析显示出改善的结合亲和力。（A) 通过在包被的CRIgwt和CRIgQ64RM86Y蛋白质上注射渐增浓度的C3b产生的SPR传感 图。（B)对结合数据的稳态分析指示Q64R/M86Y突变体和野生型CRIg的Kd为0. 2微摩尔 和I. 1微摩尔。
[0057] 图7 :亲和力改善的CRIg保留对C3b的选择性。对纯化的C3和C3b利用a筛选 竞争性测定法。
[0058] 图8:CRIgQ64RM86Y与野生型CRIg相比改善的补体抑制效力。（A)使用家兔红 血球和Clq消减的人血清使用旁路途径选择性溶血测定法比较野生型CRIg和CRIgQ46R M86Y的补体抑制。（B)用微孔板上包被的LPS和Clq消减的人血清使用基于ELISA的旁路 途径测定法比较野生型CRIg和CRIgQ46RM86Y的补体抑制。
[0059] 图9:CRIgQ64RM86Y在体内显示出胜过CRIgWT改善的功效。
[0060] (A)注射KRN血清并用各种浓度和型式的野生型和亲和力成熟的重组人和小鼠 CRIg蛋白质处理的小鼠的临床得分。数据代表每组4-7只小鼠的均值。（B)来自血清转移 后第6天的各只小鼠的临床得分的散布图。（C)血清转移后6天用CRIgwt或CRIgQ64R M86Y处理的小鼠的苏木精和曙红染色切片。（D)来自血清转移后6天用CRIgwt或CRIg Q64RM86Y处理的小鼠的组织学得分的散布图。
[0061] 发明详述
[0062] I?定义
[0063] 术语"0?18"、叩肋362"、"从114"、和"31^麻"可互换使用，指天然序列和变体0?1 8 多肽。
[0064] "天然序列"CRIg指与从自然界衍生的CRIg多肽具有相同氨基酸序列的多肽，不 管其制剂形式。如此，天然序列CRIg可以从自然界分离，或者可以通过重组和/或合成手段 生成。术语"天然序列CRIg"明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的CRIg(例如胞外结构 域序列）、CRIg的天然存在的变体形式（例如可变剪接形式）和天然存在的等位变体。天 然序列CRIg多肽明确包括SEQIDN0:2的全长的长399个氨基酸的人CRIg多肽（huCRIg， 图IA和IB所示），含或不含N端信号序列，含或不含第1位处的起始甲硫氨酸，及含或不 含SEQIDNO: 2大约第277-307位氨基酸处的任何或所有跨膜结构域。在又一个实施方案 中，天然序列CRIg多肽是305个氨基酸的短形式的人CRIgOiuCRIg-短（huCRIg-short)， SEQIDNO: 4,图2A和2B所示），含或不含N端信号序列，含或不含第1位处的起始甲硫氨 酸，及含或不含SEQIDN0:4大约第183-213位处的任何或所有跨膜结构域。在一个不同 的实施方案中，天然序列CRIg多肽是SEQIDNO:6的长280个氨基酸的全长鼠CRIg多肽OmiCRIg，图3A-3C所示），含或不含N端信号序列，含或不含第1位处的起始甲硫氨酸，及含 或不含SEQIDN0:6大约第181-211位氨基酸处的任何或所有跨膜结构域。其它非人动物 (包括高等灵长类和哺乳类）的CRIg多肽被明确包括在此定义内。
[0065] CRIg"胞外结构域"或"E⑶"指CRIg多肽的基本上不含相应全长分子的跨膜和胞 质结构域的一种形式。通常，CRIgE⑶具有少于1 %的此类跨膜和/或胞质结构域，而且优 选具有少于0.5%的此类结构域。CRIgE⑶可包含SEQIDNO:2, 4,或6的氨基酸残基1 或约21至X，其中X是SEQIDNO: 2中约271至281的任何氨基酸、SEQIDNO: 4中约178 至186的任何氨基酸、和SEQIDNO:6中约176至184的任何氨基酸。
[0066] 如本文中所使用的，术语"CRIg变体"指如下文所定义的天然CRIg多肽，其与天 然序列CRIg多肽具有至少约80 %氨基酸序列同一性，包括但不限于全长huCRIg(SEQID N0:2)、huCRIg-short(SEQIDN0:4)、和muCRIg(SEQIDN0:6)，各自有或无N端起始甲硫 氨酸，有或无N端信号序列，有或无整个或部分跨膜域及有或无胞内域。在一个具体的实施 方案中，CRIg变体与来自序列SEQIDN0:2之序列内的成熟的全长多肽具有至少约80%氨 基酸序列同源性。在另一个实施方案中，CRIg变体与来自序列SEQIDN0:4内的成熟的全 长多肽具有至少约80%氨基酸序列同源性。在还有一个实施方案中，CRIg变体与来自序 列SEQIDN0:6内的成熟的全长多肽具有至少约80%氨基酸序列同源性。通常，CRIg变体 会与来自SEQIDN0:2,4,或6内的成熟氨基酸序列具有至少约80%氨基酸序列同一性，或 至少约85%氨基酸序列同一性，或至少约90%氨基酸序列同一性，或至少约95%氨基酸序 列同一性，或至少约98%氨基酸序列同一性，或至少约99%氨基酸序列同一性。贯穿本说 明书，包括实施例，术语"野生型"或"WT"指人CRIg的成熟全长短形式（CRIg(S))(SEQID NO: 4)，而且CRIg变体中的氨基酸残基的编号方式指序列SEQIDNO: 4
[0067] 本发明的CRIg变体是CRIg激动剂，如下文所定义的。具体而言，本文中的CRIg 变体维持选择性结合C3b胜过C3,其中"选择性结合"用于指结合C3b且不结合C3。另外， 在一个优选的实施方案中，本发明的CRIg变体具有相对于天然序列CRIg多肽，诸如CRIg 的人长型（SEQIDN0:2)提高的对C3b的结合亲和力。在各种实施方案中，相对于天然序 列人CRIg多肽SEQIDNO: 2,结合亲和力的提高是至少约2倍，或至少约3倍，或至少约4 倍，或至少约5倍，或至少约6倍，或至少约7倍，或至少约8倍，或至少约9倍，或至少约10 倍，或至少约15倍，或至少约20倍，或至少约25倍，或至少约30倍，或至少约35倍，或至少 约40倍，或至少约45倍，或至少约50倍，或至少约55倍，或至少约60倍，或至少约65倍， 或至少约70倍，或至少约75倍，或至少约80倍，或至少约85倍，或至少约90倍，或至少约 95倍，或至少约100倍。在其它实施方案中，相对于天然序列人CRIg多肽SEQIDN0:2,对 C3b的结合亲和力的提高是约5-10倍，或约5-15倍，或约5-20倍，或约5-25倍，或约5-25 倍，或约5-30倍，或约5-35倍，或约5-40倍，或约5-45倍，或约5-50倍，或约5-55倍，或 约5-60倍，或约5-65倍，或约5-70倍，或约5-75倍，或约5-80倍，或约5-85倍，或约5-90 倍，或约5-95倍，或约5-100倍。
[0068] 关于本文中CRIg变体的"百分比（％)氨基酸序列同一性"定义为对比序列并 在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性 的一部分时，CRIg变体序列中与它们与之比较的天然CRIg序列中的氨基酸残基相同的氨 基酸残基的百分率。对于长度不同的序列，百分比序列同一性是相对于较长的序列，沿着 较长序列的全长测定的。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范 围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比 较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然后相对于较长的序列计算序列同一性，即， 即使较短的序列显示与较长的序列一部分的100%序列同一性，整体序列同一性也会小于 100%〇
[0069] 关于本文中鉴定的CRIg变体编码序列的"百分比（％)核酸序列同一性"定义为分 别对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与CRIg变 体编码序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。为测定百分比核酸序列同一性目的的对比 可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、 BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜 参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然后相对于较长的序列计算 序列同一性，即，即使较短的序列显示与较长的序列一部分的100%序列同一性，整体序列 同一性也会小于100%。
[0070] CRIg变体的定义中包括所有氨基酸序列变体，如上文所定义的，不管它们的鉴定 或制备模式。具体而言，本文中包括通过替代、化学的、酶促的、或通过其它适宜手段用天然 存在氨基酸以外的模块经过修饰的变体，只要它们保留天然序列CRIg的定性生物学特性。 例示性的非天然存在氨基酸替代包括下文描述的那些。
[0071] 氨基酸残基归入四大组：
[0072] 酸性的：这种残基在生理pH由于丢失H离子而具有负电荷，而且当包含这种残基 的肽在水溶液中时，该残基受水溶液吸引以寻找该肽的构造中的表面位置。
[0073] 碱性的：这种残基在生理pH由于结合H离子而具有正电荷，而且当包含这种残基 的肽在生理PH的水溶液中时，该残基受水溶液吸引以寻找该肽的构造中的表面位置。
[0074] 中性的/非极性的：这种残基在生理pH不带电荷，而且当包含这种残基的肽在水 性介质中时，该残基受水溶液排斥以寻找该肽的构造中的内部位置。这些残基也称作"疏水 性残基"。
[0075] 中性的/极性的：这种残基在生理pH不带电荷，但是当包含这种残基的肽在水性 介质中时，该残基受水溶液吸引以寻找该肽的构造中的外部位置。
[0076] 氨基酸残基可以关于它们的侧链基团进一步分类为环状的或非环状的，芳香族的 或非芳香族的，这些指派对于熟练技术人员是平常的。
[0077] 常常遇到的氨基酸不是由遗传密码编码的氨基酸，包括用于Glu和Asp的2-氨基 己二酸（Aad);用于Glu和Asp的2-氨基庚二酸（Apm);用于Met，Leu和其它脂肪族氨基 酸的2-氨基丁酸（Abu);用于Met，Leu和其它脂肪族氨基酸的2-氨基庚酸（Ahe);用于 Gly的2-氨基异丁酸（Aib);用于Val和Leu和Ile的环己基丙氨酸（Cha);用于Arg和 Lys的高精氨酸（Har);用于Lys，Arg和His的2, 3-二氨基丙酸（Dpr);用于Gly，Pro和 Ala的N-乙基甘氨酸（EtGly);用于Gly，Pro和Ala的N-乙基甘氨酸（EtGly);用于Asn 和Gln的N-乙基天冬酰胺（EtAsn);用于Lys的轻赖氨酸（Hyl);用于Lys的别轻赖氨酸 (AHyl);用于Pro，Ser和Thr的 3(和 4)-轻基脯氨酸（3Hyp，4Hyp);用于lie，Leu和Val 的别异亮氨酸（AIle);用于Ala的P-脒基苯丙氨酸；用于Gly，Pro和Ala的N-甲基甘氨 酸（MeGly，肌氨酸）；用于Ile的N-甲基异亮氨酸（MeIle);用于Met和其它脂肪族氨基酸 的正缴氨酸（Nva);用于Met和其它脂肪族氨基酸的正亮氨酸（Nle);用于Lys，Arg和His 的鸟氨酸（Orn);用于Thr，Asn和Gln的瓜氨酸（Cit)和甲硫氨酸亚砜（MSO);用于Phe的 N-甲基苯丙氨酸（MePhe)，三甲基苯丙氨酸，卤代（F，C1，Br和I)苯丙氨酸，三氟苯丙氨酸 (triflourylphenylalanine) 〇
[0078] 在用于本文时，术语"免疫粘附素"指将异源蛋白质（"粘附素"）的结合特异性与 免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同 于抗体的抗原识别和结合位点（即是"异源"的）、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免 疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受体或配 体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫 球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3 或IgG-4 亚型，IgA(包括IgA-I和IgA-2)，IgE，IgD 或IgM。
[0079] "治疗"或"处理"指有意预防病症的发生或改变病症的病理而实施的干预。因而， "治疗"指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的 受试者以及要预防病症的受试者。
[0080]如本文中所使用的，"改善"在本文中定义为使得更好或改进。
[0081]如本文中所使用的，术语"哺乳动物"指归为哺乳类的任何动物，包括但不限于人， 非人灵长类，家畜和牲畜，及动物园中的动物、运动用动物或宠物动物，诸如马、猪、牛、犬、 猫和雪貂等。在一个优选的实施方案中，哺乳动物指高等灵长类，最优选人。
[0082]术语"补体相关疾病"在本文中以最广义使用，包括其发病机制涉及补体系统激活 异