一类新型生长激素释放激素类似肽及其在制备治疗不孕不育药物中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于医药生物领域，具体涉及四种新型生长激素释放激素类似肽及其在制 备治疗不孕不育药物中的应用。
【背景技术】：
[0002] 人生长激素释放激素（hGHRH)，由下丘脑分泌，促进垂体合成和释放人生长激 素（hGH)的神经内分泌肽。前原蛋白hGHRH(l-107/8)前体的成熟由一系列蛋白水解加 工步骤，最终的成熟形式是hGHRH(l-44)NH2，hGHRH(l-37)OH和hGHRH(l-40)0H。在这 些GHRH分子中，具有51 %生物活性的最短序列是hGHRH(l- 29)，被称为核心肽。人下丘 脑hGHRH与猪、中华地鼠、牛、金黄地鼠、山羊、豚鼠、大鼠和小鼠的GHRH分子同源性分别有 93%，93%，89%，89%，86%，73%，71 %和 61%。
[0003]LingN等报告，相对于hGHRH(l-40)0H，D」Tyr-hGHRH(l-40)0H, 1Phe-IiGHRH(Iqo) OH, 1Trp-IiGHRH(卜40)OH, 1His-IiGHRH(卜40)OH, 1Ala-IiGHRH(卜40)OH, 1Tyr-IiGHRHaiO) OH, 9Arg-hGHRH(l-40)0H和 9Ala-hGHRH(l-40)0H分别具有 0? 022, 0? 038, 0? 003, 0? 351, 0? 01 0, 0? 032, 0? 002 和 0? 007 的活性。以hGHRH(1-44)順2作基准，（3-Me) 1His-IiGHRHai^NH2 和（O-Me) 1Tyr-IiGHRH(1-44)順2分别具有 0? 132 和 0.001 的活性。PiquetG等和Esposito P等将GHRH类似物的C-末端与聚乙二醇（PEG)耦合以获得具有较高稳定性的GHRH-PEG 分子。带有C-末端酰胺化的GHRH类似物具有翻倍活性。IzdebskiJ等在hGHRH(l-29) NH2分子骨架的29位（胍基丁胺Agm)，1位（脱氨酪氨酸Dat)，27位（亮氨酸Nle)和15 位（L-a-氨基丁酸Abu)改构，合成了JI-34,JI-36和JI-38(JI系列）的GHRH激活剂。 HassanHA等在hGHRH分子的1Tyr和 / 或27Met位改构，1His, 27Nle-hGHRH(1-32)NH2,1Hi s,mon〇-I-lclTyr，27Nle-hGHRHa_32)NH2,27Nle-hGHRH(1-29)NH2,D-1Tyr-IiGHRH(I-SS)NHjP desJTyr-hGHRHd〗#%的活性分别比hGHRH(l-40)0H高 3. 2, 4. 9,I. 4, 0? 74 和 0? 02 倍。 GarciaJM等报道，Macimorelin(以前叫AEZS-130，ARD-07 或EP-01572)是具有很好稳定 性和口服生物利用率的新GH分泌剂，但是它的hGH释放效果远远低过hGHRH(l-29)NHd9 活性。CaiR等报道，在JI系列的N端N-Me-Tyr,C端methyl-或ethyl-amide,Apa30_ 或 6&匕30-順2改构，这些改构化合物N-Me- 1Tyr-JHS,N-Me-1Tyr,D-2Ala-JI-38,N-Me-1Tyr, D-2Ala, 8Asn-JI-38,N-Me-1Tyr,D-2Ala, 29Arg-NHCH3-JI-38,N-Me-1Tyr, 29Arg-NHCH3-JI-38 ,N-Me-1Tyr,D-2Ala, 8Asn, 29Arg-NHCH3-JI-38,N-Me-1Tyr,D-2Ala, 8Thr, 29Arg-NHCH3-JI-38. N-Me-1Tyr,D-2Ala, 29Arg, 3°Apa-NH2-JI-38 和D-2Ala, 5F-6Phe, 28Ser, 29Arg, 3°Gab-NH2-JI-38 的活性是hGHRH(l-29)OH的1-7. 01倍。HassanHA等在hGHRH分子中的位置1Tyr和/ 或27Met位改构，1His,27Nle-IiGHRH(I-Ss)NH211His1Iiiono-I-1c1Tyr127Nle-IiGHRH(I-SS)NH2, 27Nle-hGHRH(1-29)NH2,D-1Tyr-IiGHRH(1-32)順2和des- 1Tyr-IiGHRH(2-32)NH2的活性分别为 hGHRH(l-40)0H的3. 2, 4. 9, 1. 4, 0. 74和0. 02倍。到现在为止，所有被报道的GHRH激 活剂中，hGHRH(1-44)順2分子活性最高。
[0004] 最近研宄发现，GHRH肽具有垂体外的广谱活性，如促进伤口愈合、保护心肌细胞凋 亡、提高睡眠质量、减少糖尿病或艾滋病中的肥胖和改善神经认知功能等。
[0005] 虽然hGHRH类似物在生物医学上具有巨大的潜在应用，但其半衰期短和活性低是 主要限制。我们以前的工作发现，N端1Tyr-Pro替换和/或hGHRH(l-44)OH的C-末端 GGC扩展可有效调控这各激素的活性。最近发现，在hGHRH(l- 44)分子的N-端Pro-1Pro-或 1Pro-延伸或代换，和C端GGC延伸的同源二聚体意外表现出比hGHRH(1 - 44)见12更高的生 长激素释放活性。本说明书报道这四个新性高活性hGHRH类似物的合成、生物评价和药效。
【发明内容】
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[0006] 本发明的第一个目的是提供一类新型生长激素释放激素类似肽。
[0007] 所述的新型生长激素释放激素类似肽为2D、2E、2F或2Y二聚体肽；
[0008] 所述的2D二聚体肽的氨基酸序列为：
[0009] (H)PPYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(OH)CGGLRARA GREQNSEGQQRSMIDQLLKRASLQGLVKRYSNTFIADAYPP(H)；
[0010] 所述的2E二聚体肽的氨基酸序列为：
[0011] (H)PYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(OH)CGGLRARAG REQNSEGQQRSMIDQLLKRASLQGLVKRYSNTFIADAYP(H)
[0012] 所述的2F二聚体肽的氨基酸序列为：
[0013] (H)PADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(OH)CGGLRARAGR EQNSEGQQRSMIDQLLKRASLQGLVKRYSNTFIADAP(H)；
[0014] 所述的2Y二聚体肽的氨基酸序列为：
[0015] (H)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(OH)CGGLRARAGR EQNSEGQQRSMIDQLLKRASLQGLVKRYSNTFIADAY(H)。
[0016] 上述2D、2E、2F或2Y二聚体肽的氨基酸序列中的大写字母为氨基酸的简写，这属 于公知常识。其中H代表氨基位于N端，OH代表羧基COOH位于C端，这也属于本领域的公 知常识。
[0017] 本发明通过实验发现，上述2D、2E、2F或2Y二聚体肽通过体外氧化单体D、E、F或 Y形成二聚体。二聚体肽经过垂体保温测试，发现具有很高的垂体GH释放活性和垂体激素 释放特异性。经过垂体GHRH受体结合反应和垂体细胞荧光染色分析，2F二聚体肽具有最大 结合垂体受体活性。
[0018] 以2F二聚体肽为代表对对雄性不孕不育模型治疗发现：与生理盐水组和单纯环 磷酰胺对照组比较，2F二聚体肽组的睾丸曲细精管中细胞排列整齐，管中的精原细胞、精母 细胞、精子细胞和成熟精子明显增加，曲细精管体积变粗，曲细精管腔变小，甚至消失，药效 呈现剂量依赖性。
[0019] 以2F二聚体肽为代表对对雌性不孕不育模型治疗发现：怀孕率统计显示，与单纯 环磷酰胺组比较，2F组不论是出生率还是怀孕率都有明显增多，与阳性促性腺激素HMG组 比较，2F组有多个出生小鼠，而HMG组有多个中晚期怀孕鼠。卵泡数统计显示，2F组的成熟 卵泡数比其它各组都多，而HMG组的初级和次级卵泡增加明显。H-E染色法显示：与正常生 理盐水对照组比较，单纯环磷酰胺模型组细胞排列紊乱，失去正常腺体结构，染色不均，细 胞核固缩。经过2F肽治疗后，细胞排列较整齐，有正常腺体结构，染色均匀，显示该肽对卵 巢结构具有明显保护作用。2F组卵巢边缘可见大量成熟卵泡，有明显的促卵泡成熟现象，具 有剂量依赖性。利用FITC-hGHRH(l-44)NH2肽的荧光染色显示，在初级和次级卵泡和卵巢 组织中，有许多细胞有明显FITC黄色荧光标记，显示有GHRH受体分布。这些结果证实新型 GHRH激素肽通过GHRH受体发挥作用，促进卵细胞的增殖和成熟，促进受孕。
[0020] 这些说明，以2F二聚体肽为代表的GHRH二聚体肽，如2D、2E和2Y二聚体，具有明 显刺激精、卵细胞增殖和成熟作用，从而促进生殖，因此能够用于男女不孕不育药物。
[0021] 因此本发明的第二个目的是提供2D、2E、2F或2Y二聚体肽在制备治疗不孕不育药 物中应用。
[0022] 本发明的第三个目的是提供一种治疗不孕不育药物，其特征在于，以所述的新型 生长激素释放激素类似肽2D、2E、2F或2Y二聚体肽作为活性成份。
[0023] 文中所述的2D、2E、2F或2Y二聚体肽其简称分别为2D、2E、2F或2Y肽。
[0024] 本发明的2D、2E、2F或2Y肽能够用于治疗男女不孕不育，因此为治疗不孕不育提 供了候选药物。
【附图说明】：
[0025] 图1是Sl肽的HPLC纯度分析和MS的分子量鉴定图；
[0026] 图2是S2肽的HPLC纯度分析和MS的分子量鉴定图；
[0027] 图3是A肽的HPLC纯度分析和MS的分子量鉴定图；
[0028] 图4是B肽的HPLC纯度分析和MS的分子量鉴定图；
[0029] 图5是C肽的HPLC纯度分析和MS的分子量鉴定图；
[0030] 图6是D肽的HPLC纯度分析和MS的分子量鉴定图；
[0031] 图7是E肽的HPLC纯度分析和MS的分子量鉴定图；
[0032] 图8是F肽的HPLC纯度分析和MS的分子量鉴定图；
[0033] 图9是2D、2E、2F和2Y二聚体肽的SDS-PAGE图。Markers:低分子量蛋白质标准 4. 6-66KDa;2D、2E、2F和2Y分别代表2D、2E、