长效生长激素释放因子衍生物的制作方法

专利名称：：长效生长激素释放因子衍生物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生长激素释放因子(GRF)衍生物。特别的，本发明涉及具有体内半衰期延长的GRF肽衍生物，用于促进人和动物体内源性产生或释放生长激素。
背景技术：
：生长激素(GH)也叫做促生长素，是一种由腺垂体的促生长激素细胞合成和分泌的大约190个氨基酸的蛋白激素。它是控制生长和代谢的一种主要参与者。它也是用于人和动物的重要药用产物。GH的产生受多种因素的调节，其中包括应激、营养、睡眠以及GH自身。但是其主要控制者是两种下丘脑激素-生长激素释放因子(GRF或GHRH)，其是剌激GH合成和释放的44个氨基酸的序列，和；-抑生长素(SS)，响应于GRF其抑制GH释放。GRF(l-44)的生物活性已表明存在于肽的N末端区。采用GRF(1_29)在体内和体外也证实有全部内在的活性和效力。此外，持续给药GRF诱导从脑下垂体与正常生理条件下相同的阵发式分泌模式。近来，由Merck和其它的制药公司开发的合成肽，例如生长激素释放肽(GHRP)和模拟肽(p印tidomimetics)已经阐述了其能够剌激内源性GH的释放。由Hoffma皿-LaRoche在80年代中期开发的另一种三取代的GR巳—29类似物，[脱_氨基-Tyr1，D-Ala2，Ala"]-GRFh29，是一种具有长效活性的GRF超级激动剂。已知GH促分泌素(GHS)通过一种孤儿G-蛋白偶联受体(GHS-R)剌激GH从垂体释放。近来，用于GHS-R的另一个内源性配体被鉴定为饥饿激素(ghrelin)，它是一种辛酰基化肽(在Ser3位有n-辛酰基的28-残基肽)。重组GH(rGH)最早在1985年生产，现在市场上医用和兽医用的rGH有售。但是还没有长效安全的rGH。此外，已经报道在人体使用rGH导致的一些副作用，即左心室质量指数、血清脂蛋白的升高以及免疫参数的细微改变。最后，已知频繁浓注rGH导致受体的渐进性下调，因此随着时间的流逝使其疗效下降。除了这些应用上的缺点，外源性GH是物种特异性的，因此限制了其在不同物种即人和动物中促进生长和其它有利影响的优点。已经发现少量的GRF导致主要垂体释放GH到处理的动物的血液中。因此，在这些显示生长激素的情形中GRF具有很好的治疗价值。例如，它可用于治疗垂体侏儒症，由于GH产生异常导致的糖尿病，以及老化过程的延迟。受益于GRF内源性产生和释放的很多其他疾病或症状在下面列举。此外，GRF也可用于农业方面。农业应用的实例包括促进猪、牛或类似的家畜的产肉以尽早进入市场。已知GRF也可剌激奶牛的产奶量。到目前为止，与肽-相关的GH促分泌素的使用相关的一个主要缺点是缺少一种合适的技术，其能够在延长的时间内，例如几天到几星期，提供基本上线性和持续地递送GH。5GRF(l-29)，就像很多其它具有治疗特性的肽一样，在体内高度不稳定，这就大大限制了其作为药用产物在促进人和动物释放GH中的应用。因为GRFl-29的半衰期一般情况下不超过10-13分钟，因此一天中必须若干次大剂量注射或输注才能维持可检测的GH的释放。在过去的这些年中已开展了大量的研究以试图开发出长效的GRF类似物。虽然合成了若干具有延长作用时效的新的类似物，但是没有一种满足GH释放药品所需要的标准。另外，没有一种制型已知在人或动物体内在一段确定的时间内释放这些不稳定的肽。US5，846，936公开的GRF类似物据说具有增强的效力，提高的酶稳定性和改进的半哀期稳定性。这个专利提及这些类似物可以用多种类似血清白蛋白的佐剂进行给药。专利中呈现的唯一半衰期稳定结果是体外的。实际上没有体内肽稳定性的数据。US4，963，529描述了一种GRF组合物，以液体或固体的形式，其包含GRF以及人血清白蛋白或甘氨酸。组合物中也可以包含缓冲液，据说可以稳定GRF。W09724445公开了将生长激素(hGH)和重组白蛋白分子融合。这样的融合蛋白据说较未融合的生长激素提高了循环半衰期。任选可切割的连接物可以被插入到白蛋白和生长激素的分子之间以促进hGH和受体的连接。W00069900公开了一种生产肽酶稳定性肽的方法。一系列GRF肽被列举作为可能的候选物，可通过本申请公开的方法加以稳定，但是没有一种在说明书中具体举例。因此迫切需要开发一种能够促进GH在受试体、人或动物体内释放的长效化合物。这样的促进应该优选持续一段延长的时间而没有rGH不受欢迎的副作用。发明概述根据本发明，提供了一种生长激素释放因子(GRF)衍生物，其与相应的未修饰的(或天然的)GRF肽序列比较有延长的体内半衰期。更具体而言，该衍生物包括一种GRF肽或其类似物，它含有与其偶联的反应实体并能够与一种血液组分上的有效官能团，在体内或体外形成稳定共价键。反应实体可被偶联到肽的N-末端、C-末端或沿着肽链的任何其他有效的位置。优选的血液组分含有类似免疫球蛋白的蛋白，包括IgG和IgM、血清白蛋白、铁蛋白、类固醇结合蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合蛋白、a-2-巨球蛋白等，更优选血清白蛋白和IgG，以及血清白蛋白是最优选的。优选的反应实体能够在体内或体外(或离体)与血液组分上存在的氨基、羟基或巯基反应形成共价键。在最优选的实施方案中，蛋白的官能团为巯基，反应实体为Michael受体，如丙稀醛衍生物、a，P_不饱和酮、a，|3-不饱和酰胺、a，|3-不饱和酯、a，|3-不饱和硫酯等，马来酰亚胺或含马来酰亚胺的基团如Y-马来酰亚胺-丁酰酰胺(GMBA)或马来酰亚胺丙酸(MPA)是最优选的。本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其包含该GRF衍生物和可药用载体。该组合物用于促进内源性GH在受试者体内的产生和释放。该组合物也可用于生产药用或兽药用组合物以治疗或预防由于GH产生异常导致的疾病或症状。下面列举了这样的疾病或症状。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种促进GH在受试体、动物或人中内源性产生或释放的方法。该方法包括对受试体单独或与药用载体结合给药有效剂量的该GRF衍生物。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种治疗或预防由于GH产生异常导致的疾病或症状，该方法包括对受试体单独或与药用载体结合给药有效剂量的该GRF衍生物。本发明的另一方面提供了一种包含共价连接到血液组分的该GRF衍生物的偶联物。本发明的另一方面提供了一种体内延长GRF肽在受试体内半衰期的方法，该方法包括将该GRF衍生物共价连接到一种血液组分。共价连接可以发生在体内也可发生在体外。优选的GRF是如GRF(1-44)和其类似物的肽，例如GHRP_6、海沙瑞林(Hexarelin)、饥饿激素、GHRP-1、IGF-l、IGF_2、B_HT920、GRF(1_29)和如下列举的它们的类似物和片段，条件是任何这样的类似物或片段具有与GRF基本相似的活性。根据本发明，所有在此引用作为参考的US4，411，890;US4，517，181;US4，518，586;US4，528，190;US4，529，595;US4，563，352;US4，585，756;US4，595，676;US4，605，643;US4,610,976;US4，626，523;US4，628，043;US4，689，318;US4，734，399;US4，784，987;US4，843，064;US5，756，458;EP0188214;WO89/07110;WO89/07111和WO93/04081提供了适宜作为衍生物的其它的GRF类似物。如果连接基团存在于反应实体和GRF肽之间，则将其无限制地优选定义为直链或支链(Vw烷基；部分氟化或过氟化的直链或支链的C卜w烷基；(Vw烷基或氟烷基，其中一个或多个碳原子被0或S取代以形成醚或硫醚，例如-Z-CH2CH2-、-Z-CF2CH2-、-Z-CH2CF2-或_Z_CF2-CF厂其中Z为O或S;o-、m-或p-二取代苯基，其中取代基相同或不同，并且为CH2、0、S、NH、NR，其中R为H、Q—1Q烷基或1Q酰基；或二取代杂环，如呋喃、噻吩、妣喃、唑或噻唑。图1显示用市售GRF(1-29)和实施例1和2的不同浓度的化合物培养4小时后，大鼠前原代细胞的GH分泌。图2显示用市售D-Ala-GRF(l-29)和实施例3和4的不同浓度的化合物培养4小时后，大鼠前原代细胞的GH分泌。图3显示用实施例5和6的不同浓度的化合物培养4小时后，大鼠前原代细胞的GH分泌。图4显示用实施例7和8的不同浓度的化合物培养4小时后，大鼠前原代细胞的GH分泌。图5显示单次皮下浓注(bolusinjection)实施例1和2的化合物后，正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌。图6显示单次皮下浓注实施例3和4的化合物后，正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌。图7显示单次皮下浓注实施例5和6的化合物后，正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌。图8显示单次皮下浓注后正常Sprague-Dawley大鼠的GH分泌(曲线下的总面积，AUC)。图9显示雄性Sprague-Dawley大鼠中实施例5和6的化合物的药代动力学图形。本发明的详细描述体内生物偶联是在体内以一定方式将分子，如本发明GRF衍生物，共价结合到靶血液组分，优选蛋白的过程，所述容许基本方式上保留原始未修饰的GRF的生物活性，同时通过给予GRF衍生物靶血液组分的生理参数而提供生物活性持续时间的延长。为了本发明的目的，术语"类似物"是指氨基酸序列所含有的肽与天然GRF序列不同但是有相似或同等的活性。这样的类似物优选与相同数目氨基酸残基的GRF或GRF片段的氨基酸序列有至少60%的相似性，更优选至少有80%的相似性，以及最优选至少有95%的相似性。在一个较优选的实施方案中，本发明GRF衍生物含有一个GRF肽，该GRF肽直接或通过一个连接基团偶联一个反应实体而被修饰，反应实体能与一种血液组分，优选血液蛋白形成共价键。反应实体必须在水环境中稳定存在，其优选的实施方案包括羧基、磷酰基、亚胺酸基(imidate)或酰基形成酯或混合酐。共价键通常在反应实体与血液组分上的氨基、羟基或巯基之间形成。氨基优选与如羧基、磷酰基或酰基的反应实体形成共价键；羟基优选与活化酯的反应实体形成共价键；以及巯基优选与如酯或混合酐的反应实体形成共价键。优选的血液组分包括移动的血液组分，例如血清白蛋白、免疫球蛋白或二者的混合物，优选的反应实体含有类似马来酰亚胺基团的酐，在最优选的实施方案中，血液组分为血清白蛋白。血液组分优选是移动的，这就意味着血液组分不必在任何长时间内有固定位置，一般不超过5分钟，更经常不超过1分钟。这些血液组分不与膜相关并且在血液中以最低至少0.1i！g/ml的浓度下存在较长时间。优选的移动血液组分包括血清白蛋白、转铁蛋白、铁蛋白和类似IgG和IgM的免疫球蛋白。移动血液组分的半衰期至少约12小时。因为本发明GRF衍生物包括一种肽，在衍生物的合成过程中可能需要保护基团。这些保护基团在肽合成领域是常规的，并且一般被描述为能够防止肽衍生物与其自身反应的化学部分。多种保护基团都是市售的，其实例可在US5，493，007找到，此处引作参考。适合作为保护基的典型例子包括乙酰基、9-芴甲氧羰基(FMOC)、叔-丁基氧羰基(BOC)、苄氧羰基(CBZ)等。表1提供了氨基酸的三字母和单字母縮写。表1天然氨基酸及其縮写名称三字母縮写单字母縮写丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明GRF衍生物与血液组分连接后形成了一种肽酶稳定的长效化合物。预期在添加反应实体之前可以添加一个或多个其它的氨基酸，以促进肽的偶联。这样的添加可以在C-末端、N-末端或二者之间进行。这样获得的肽可被施用给受试者、动物或人，从而在体内发生与血液组分的偶联，或者，首先在体外与受试者、动物或人的血液组分相连，然后将得到的偶联物或如下描述的长效肽酶稳定的肽衍生物施用给受试者。GRF序列上取代或添加的任何氨基酸可以是D-氨基酸或L_氨基酸或其组合。一般优选L-氨基酸。下列原始GRF肽序列(1-29)或(1-44)中的取代或突变代表本发明优选的实施方案，以独立或组合方式第2位的D-丙氨酸；第8位的谷氨酰胺；第11位的D_精氨酸；第12位的(N-Me)Lys;第15位的丙氨酸和第27位的亮氨酸。本发明也包括GRF片段，虽然其基本上同源于自然存在的GRF肽，但是可能在氨基端和/或羧基端缺少GRF天然肽自然存在的一个或多个其它的氨基酸。因此本发明涉及的GRF的多肽片段可能缺少GRF天然序列中正常存在的一个或多个其它的氨基酸，条件是，这样的多肽具有优选至少大体上与GRF等同的生长激素释放活性。本发明也包括与上述类似物或片段具有明显或细小区别的变体，其具有不重要的氨基酸取代(因此具有区别于天然序列的氨基酸序列)，条件是，这样的变体具有与GRF基本相似的生长激素释放活性。明显或细小取代的例子包括一个碱性残基被另一个碱性残基取代(即Arg取代Lys)，疏水残基被另一个疏水残基取代(即Leu取代lie)，或者芳族残基被另一个芳族残基取代(即Phe取代Tyr)等。此外，其它微小的变体包括类似物，其中获得了导致原始序列主要结构类似的保守取代。这样保守取代的例子包括但不限于谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然；谷氨酰胺取代天冬酰胺，反之亦然；丝氨酸取代苏氨酸，反之亦然；赖氨酸取代精氨酸，反之亦然；或者任何异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸之间的彼此取代。肽酶稳定的GRF衍生物在体内有肽酶存在的情况下，较相应的非稳定的GRF类似物更稳定。通过将在血清中或血液中天然GRF类似物的半衰期与在血清中或血液中含有活性基团的相应衍生物的半衰期进行比较来确定肽酶稳定性。半衰期的测定方法是在给药衍生物和非修饰的肽后取血清或全血样品，以及确定每种化合物的活性。更具体而言，本发明涉及GRF和相关肽的修饰以提高其生物利用率，在基本上不改变其显著治疗特性的情况下通过选择性偶联到一种血液组分而延长其体内半衰期和分布。在一个较优选的实施方案中，根据本发明适于衍生的GRF肽序列为下列序列A「A2-Asp-A4-Ile-Phe-A厂A8-A9-Tyr-An-Ai2-Ai3-Leu-Ai5-Gln-Leu-Ai8-Ala-A2o-A^_A22_Leu_A24_A25_A26_A27_A28_A29_A30其中，为Tyr、N_Ac_Tyr、His、3-MeHis、脱氨基His、脱氨基Tyr、Lys-Tyr、Lys-His或Lys_3_MeHis;A2为Val、Leu、Ile、Ala、D-Ala、N-甲基-D-Ala、(N_甲基)-Ala、Gly、Nle或Nval;A4为Ala或Gly;As为Met或Ile;A7为Asn、Ser或Thr;A8为Asn、Gln、Lys或Ser;A9为Ala或Ser;Au为Arg、D-Arg、Lys或D-Lys;A12为Lys、(N_Me)Lys或D-Lys;A13为Val或Leu;A15为Ala、Leu或Gly;A18为Ser或Thr;A20为Arg、D_Arg、Lys或D_Lys;A21为Lys、(N_Me)Lys或Asn;A22为Tyr或Leu;A24为Gln或His;A25为Ser或Asp;A26为Leu或Ile;A27为Met、Ile、Leu或Nle;A28为Ser、Asn、Ala或Asp;A29为Lys或Arg;禾口A3。为缺失、X或X-Lys，其中X缺失或者为序列Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其中的一个片段，其中该片段在C-末端被縮减了1到15个氨基酸；并且来自片段的一个氨基酸残基可任选被一个lys残基取代；以及其中的C-末端可以是游离羧酸或相应的酰胺，限制条件是，如果A2为Ala，该片段就不是被縮减了5-8个氨基酸的片段。本发明涉及具有体内半衰期延长的GRF衍生物的治疗及相关应用，特别适用于-提高生长激素的水平；-通过给受试者施用本发明GRF衍生物类似物并检测生长激素反应来诊断生长激素缺陷；-治疗垂体侏儒症；-治疗或预防生长延迟；-加速骨折修复或伤口愈合；_加速烧伤患者或进行大手术患者的恢复；-提高肌肉力量，活动性，保持皮肤厚度，代谢平衡或肾平衡；-治疗或预防充血性心力衰竭；-治疗或预防与老化相关的虚弱；-治疗或预防骨质疏松症；-治疗或预防肥胖；-减少大手术后蛋白代射反应；-减少慢性病导致的恶病质和蛋白丧失；-提高蛋白合成代谢(包括节约蛋白作用)；_诱导脂解效应；和/或_提升促生长激素细胞功能。上述所有方法均可用于人或动物。除了促进生长激素的内源性产生或释放，本发明GRF衍生物可能在GRF肽"主链"内的一个或多个位点掺入氨基酸取代，或者为GRF种的变体，其中C-末端和/或N-末端通过添加一个或多个碱性残基而被改变，或者被修饰以掺入肽化学领域传统使用的封闭基团类型从而保护肽末端免于体内不需要的生化攻击和降解。因此，本发明GRF衍生物在任何GRF物种的情况下掺入一个氨基酸取代，包括但不限于人GRF、牛GRF、大鼠GRF、猪GRF等，很多作者都报告了它们的序列。在一个更优选的实施方案中，一个赖氨酸残基被添加到GRF肽序列的C-末端或N-末端。在一个优选的实施方案中，蛋白上的官能团为巯基，反应实体为马来酰亚胺或含马来酰亚胺的基团例如Y-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA)、马来酰亚胺丙酸(MPA)、(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)-MPA、乙二胺(EDA)-MPA或[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)-MPA和它们的组合物。组合的例子包括但不限于(AEEA-EDA)-MPA、(AEEA-AEEA)-MPA、(AEA-AEEA)-MPA等。当反应混合物的pH保持在6.5和7.4之间，马来酰亚胺基团最适合在肽上选择巯基。在pH7.0，马来酰亚胺基团和巯基的反应比率较与胺反应快1000倍。马来酰亚胺基团和巯基之间形成的一个稳定的巯醚键在生理条件下不能被切开。本发明的GRF衍生物提供了血液组分的特异性标记。这样的特异性标记，特别是用马来酰亚胺基标记的，有很多优点。巯基在体内较氨基少，其结果是马来酰亚胺衍生物与较少量的蛋白共价结合。例如，在血清白蛋白中，每分子只有一个游离巯基。因此，GRF-马来酰亚胺-白蛋白结合物往往包括约1:l摩尔比的肽和白蛋白。除了白蛋白，IgG分子(II型)也有游离巯基。因为IgG分子和血清白蛋白组成了血液中可溶蛋白的大部分，它们也组成了适于共价连接到马来酰亚胺取代的GRF的游离巯基的大部分。此外，即使在含游离巯基的血液蛋白中，马来酰亚胺的特异标记由于白蛋白本身的唯一特性导致肽-马来酰亚胺-白蛋白结合物优选形成。在物种内高度保守的白蛋白单个游离巯基位于Cys^氨基酸残基处。最近发现白蛋白的Cys^相对于其它含游离巯基的蛋白的游离巯基有增强的活性。这部分归功于白蛋白Cys^的非常低的pK值5.5。这个值大大低于一般Cys残基的典型pK值，大约为8。由于这个低pK值，在正常生理条件下，白蛋白的Cys34主要为离子化的形式，大大提高了其活性。除了Cys34的低pK值，另外一种加强Cys^活性的因素为其位点，其在接近于白蛋白V区的一个环的表面的裂缝内。这个位点使得Cys34非常接近所有类型的配体，并且是Cys34作为自由基诱捕剂和游离巯基清除剂的一种重要因素。结果反应速率的促进可以比肽-马来酰亚胺和其他含游离巯基的蛋白反应速率高1000倍。肽-马来酰亚胺-白蛋白结合物的另一个优点是在Cys^处肽与白蛋白以1:1特异性负载相关的可重复性。传统的激活技术，例如用戊二醛、DCC、EDC和其它例如游离氨基的化学激活剂，就缺少这种选择性。例如，白蛋白含有52个Lys残基，其中25-30个位于白蛋白的表面，易于接近结合。这些Lys残基的激活，或者通过这些Lys残基偶联修饰肽，就会产生大量的异质结合物。即使采用等摩尔比的肽白蛋白(即l:l)，最终的结果也是产生随机的结合物，有时还出现白蛋白的每个分子连接的无数个肽的情况，并且每个结合物上，肽随机地在25-30个合适的Lys位点中任一处偶联。结果，表征准确组成几乎是不可能的，更不用提缺乏可重复性。此外，虽然看上去通过白蛋白的Lys残基的结合物至少具有每个白蛋白转运更多个治疗剂的优点，但是研究显示治疗剂和白蛋白的比率为1:l是优选的。在Stehle等，Anti-CancerDrugs，1997,8,677-685的文献中，其在此处全文引用，报道比率l:l的抗癌氨甲蝶呤和白蛋白通过戊二醛结合获得最好的结果。这些结合物被肿瘤细胞吸收，虽然结合物携带5:1到20:1的氨甲蝶呤分子改变了HPLC图谱，并且在体内被肝迅速吸收。因此似乎在更高比率处，白蛋白构造的改变减少了其作为治疗剂载体的有效性。通过控制性给药本发明GRF衍生物，特别是给药含马来酰亚胺反应实体的GRF，特异性体内标记或结合白蛋白和IgG可被控制。在典型的给药中，发现所给药的肽衍生物的80-90X结合到白蛋白上，少于5X结合到IgG上。也出现游离巯基的痕量结合，例如谷胱甘肽。这样的特异性结合在体内应用是优选的，因为能够准确计算出所给药的治疗剂的确切半衰期。12除了提供控制的体内特异性结合，马来酰亚胺取代的GRF肽可以提供离体血清白蛋白和IgG的特异性标记。这样的离体结合包括添加马来酰亚胺-肽到含有纯化的血液组分例如血清白蛋白和/或IgG的血液，血清或盐溶液中。在优选的形式下，衍生物任选通过一个连接基团被马来酰亚胺取代，并且在盐溶液中与血清白蛋白反应。一旦离体用本发明GRF衍生物进行了修饰，血液、血清或盐溶液可以被重新给药到血液用于体内治疗。在水溶液和游离氨基的存在下，马来酰亚胺取代的GRF肽一般非常稳定。因为马来酰亚胺取代的GRF肽和游离巯基反应，不需要保护基团来阻止它们和自身反应。此外，肽衍生物稳定性的提高允许使用类似HPLC的进一步的纯化过程以制备适于体内应用的高度纯化的产物。最后，化学稳定性的提高提供了具有更长保存期的产物。GRF衍生物与血液组分的目的结合物可以通过将衍生物体内直接施用给受试者进行制备，受试者可以是动物或人。给药可以以大丸剂的方式进行，或者采用计量流量输注的方式随时间慢慢导入等。或者，结合物的制备也可体外通过将血液或商业上可用的纯化血液组分与本发明GRF衍生物结合进行，使得GRF衍生物与血液组分的官能团的共价结合，并且将共价结合的血液或共价结合的纯化的血液组分返回或施用给宿主。此外，上述过程的完成可以首先纯化单个血液组分或限制数量的血液组分，例如红细胞、免疫球蛋白、血清白蛋白等，然后离体将一种或多种组分与本发明化合物衍生物结合。标记的血液或血液组分可被返回给受试者以体内提供治疗有效的结合物。血液也可被处理以预防在离体操作过程中的凝固。肽合成GRF肽的合成可以通过本领域任何普通技术人员公知的固相肽化学的常规方法进行。比如，肽的合成可以通过固相化学技术遵循Steward等在SolidPhaseP印tideSynthesis,第二片反，PierceChemicalCompany,Rockford，111.，(1984)描述的过禾呈，使用AppliedBiosystem合成仪进行。类似地，肽片段合成被结合或连在一起形成较大的肽。这些合成的肽片段也可以在特定位点进行氨基酸取代来制备。对于固相肽合成，可以在Stewart等〃SolidPhaseP印tideSynthesis〃，W.H.FreemanCo.(SanFrancisco)，1963禾口Meienhofer，HormonalProteinsandP印tides，1973，246中找到很多技术的综述。对于经典的溶液合成，参见例如Schroder等"TheP印tides"，第1巻，AcacemicPress(NewYork)。一般情况下，这样的方法包括后续添加一个或多个氨基酸或合适保护的氨基酸到一个正在生成的肽链。正常情况下，第一个氨基酸的氨基或羧基通过合适的保护基团加以保护。被保护或衍生的氨基酸在适于形成酰胺键的条件下通过在具有恰当保护的互补基团(氨基或羧基)的序列上添加下一个氨基酸或被吸着到惰性固相支持物或在溶液中被利用。然后保护基团被从这个新加入的氨基酸残基上移走，加入另一个氨基酸(经适当保护的)，反复进行。所有目的氨基酸被连接到正确的序列后，任何剩下的保护基团(和任何固相支持物)随后或者同时被移走以提供最终的多肽。通过这个一般过程的简单修饰，可以每次加入一个以上的氨基酸到生成的链上，比如，在去保护后通过用一个被正确保护的二肽偶联(在不使手性中心外消旋的条件下)一个被正确保护的三肽而形成五肽。制备本发明GRF衍生物的一个特别优选的方法包括固相肽合成，其中氨基酸a-N-末端被一个酸性或碱性敏感的基团保护。这样的保护基团应该具有的特征是，虽然在没有破坏生成的肽链或使得任何其中包含的手性中心消旋的情况下很容易移走，但是对于肽键形成的条件是稳定的。N-保护基团和C-保护基团的例子公开于Greene,〃ProtectiveGroupsInOrganicSynthesis,〃(JohnWiley&Sons,NewYork第152-186页(1981))，将其在此引作参考。N_保护基团的例子包括但不限于，低级烷酰基，例如，甲酰基、乙酰基("Ac")、丙酰基、特戊酰基、叔-丁基乙酰基等；其它酰基包括2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻硝基苯氧乙酰基、氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基例如苯磺酰基、对甲苯磺酰基、邻硝基苯磺酰基、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(pmc)等；氨基甲酸酯形成基团，例如叔-戊氧羰基、苯甲基氧羰基、对氯苯甲基氧羰基、对甲氧基苯甲基氧羰基、对硝基苯甲基氧羰基、2_硝基苯甲基氧羰基、对溴苯甲基氧羰基、3，4-二甲氧基苯甲基氧羰基、3，5-二甲氧基苯甲基氧羰基、2，4-二甲氧基苯甲基氧羰基、4-乙氧基苯甲基氧羰基、2-硝基_4，5-二甲氧基苯甲氧羰基、3，4，5-三甲氧基苯甲氧羰基、1-(对联苯基)-l-甲基乙氧羰基、a，a-二甲基-3，5-二甲氧基苯甲氧羰基、二苯甲基氧羰基、叔丁氧羰基(boc)、二异丙基甲氧基羰基、异丙基氧羰基、乙氧羰基、甲氧羰基、烯丙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、苯氧羰基、4-硝基苯氧羰基、芴基-9-甲氧基羰基、异冰片基氧羰基、环戊氧羰基、金刚烷氧羰基、环己基氧羰基、苯基硫羰基等；芳烷基例如苯甲基、二苯基异丙基氧羰基、三苯基甲基、苯甲基氧甲基、9-荷甲基氧羰基(Fmoc)等和甲硅烷基例如三甲基甲硅烷基等。优选的a-N-保护基是邻硝基苯氧硫基；9-芴甲基氧羰基叔丁基氧羰基(boc);异冰片基氧羰基；3，5-二甲氧苯甲氧羰基；叔戊基氧羰基；2-氰基-叔丁基氧羰基等，其中9-芴基甲基氧羰基(Fmoc)是更优选的，而优选的侧链N-保护基包含2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃_6-磺酰基(pmc)、硝基、对甲苯磺酰基、4-甲氧苯-磺酰基、Cbz、Boc和金刚烷氧羰基用作侧链氨基如同赖氨酸和精氨酸；苄基、邻溴苄基氧羰基、2，6-二氯苄基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、环戊基和乙酰基(Ac)用于酪氨酸；叔丁基、节基和四氢吡喃基用于丝氨酸；三苯甲基、苄基、Cbz、对甲苯磺酰和2，4-二硝基苯基用于组氨酸；甲酰基用于色氨酸；苄基和叔丁基用于天冬氨酸和谷氨酸；以及三苯甲基(trityl)用于半胱氨酸。传统的羧基保护基是指羧酸保护酯或酰胺基。这样的保护基团对于本领域的技术人员是公知的，已经广泛用于青霉素和头孢菌素领域羧基的保护，如US3，840，556和3，719，667中所述，其公开物在此引作参考。代表性的羧基保护基包括但不限于C「Cs低级烷基；芳烷基例如苯乙基或苄基及其取代的衍生物，例如烷氧苯甲基或硝基苄基；芳烯基例如苯乙烯基；芳基及其取代的衍生物例如5-茚基；二烷基氨基烷基例如二甲基氨基乙基；烷酰基氧烷基例如乙酰氧甲基、丁酰氧甲基、戊酰氧甲基、异丁酰氧甲基、异戊酰氧甲基、l-(丙酰氧)-l-乙基、l-(新戊酰氧基)-l-乙基、1_甲基丙酰氧基)-l-乙基，新戊酰氧甲基、丙酰氧甲基；环烷酰基氧烷基例如环丙基羰基氧甲基、环丁基羰基氧甲基、环戊基羰基氧甲基、环己基羰基氧甲基；芳酰基氧烷基例如苯甲酰基氧甲基、苯甲酰基氧乙基；芳烷基羰基氧烷基例如苄基羰基氧甲基、2-苄基羰基氧乙基；烷氧基羰基烷基或环烷氧基羰基烷基例如甲氧基羰基甲基、环己氧基羰基甲基、1_甲氧基羰基-l-乙基；烷氧基羰基氧烷基或环烷基氧羰基氧烷基例如甲氧基羰基氧甲基、叔丁氧基羰基氧甲基、1-乙氧基羰基氧-1-乙基、1_环己基氧羰基氧-1-乙基；芳氧基羰基氧烷基例如2_(二氮杂菲氧羰基氧)-乙基、2-(5_茚基氧羰基氧)-乙基；烷氧基烷基羰基氧烷基例如2-(1_甲14氧基-2-甲基丙烷-2-酰基氧)_乙基；芳烷基氧羰基氧烷基例如2-(苄氧基羰基氧)乙基；芳烯基氧羰基氧烷基例如2_(3-苯基丙烯_2-基氧羰基氧)乙基；烷氧基羰基氨基烷基例如叔丁氧基羰基氨甲基；烷基氨基羰基氨基烷基例如甲基氨基羰基氨甲基；烷酰基氨基烷基例如乙酰基氨甲基；杂环羰基氧烷基例如4_甲基哌嗪基羰基氧甲基；二烷基氨基羰基烷基例如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基；(5-(低级烷基)_2-氧-1，3-dioxolen-4-yl)烷基例如(5-叔丁基-2-氧-1，3-dioxolen-4-yl)甲基；和(5-苯基-2-氧-l，3-dioxolen-4-yl)烷基例如(5-苯基_2_氧_1，3-dioxolen-4-yl)甲基。代表性的酰胺羧基保护基包含但不限于甲酰胺基和低级烷基氨基羰基。在以上所述的羧基保护基中，低级烷基，环烷基或芳烷基酯，例如甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、仲丁酯、异丁酯、戊酯、异戊酯、辛酯、环己酯、苯乙酯等或烷酰基氧烷基、环烷酰基氧烷基、芳酰基氧烷基或芳烷基羰基氧烷基酯是优选的。优选的酰胺羧基保护基是低级烷基氨基羰基。在固相肽合成方法中，a-C-末端氨基酸被附着到一个合适的固相支持物或树脂上。用于上述合成的合适的固相支持物对于化学试剂和逐步縮合-去保护反应是惰性的，也不能溶于使用的介质。合成a-C-末端羧基肽的优选固相支持物为羟甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯_1%二乙烯基苯)。用于a-C-末端酰胺肽优选的固相支持物是4-(2'，4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基乙酰氨基乙基树脂，可以从AppliedBiosystems(FosterCity，Calif.)获得。该a-C-末端氨基酸，通过N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或O-苯并三唑-l-基-N，N，N'，N'-四甲基脲-六氟磷酸盐(HBTU)，有或者没有4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、l-羟基苯并三唑(H0BT)、苯并三氮唑-1-基氧_三(二甲基氨基)磷鎗_六氟磷酸盐(B0P)或二(2-氧-3-唑烷基)膦氯化物(B0PC1)被偶联到树脂上，偶联反应在例如二氯甲烷或匿F的溶剂中l(TC-5(TC温度下进行约1-约24小时。当固相支持物是4-(2'，4'-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基-乙酰氨基乙基树脂时，在如上所述与a-(:末端氨基酸偶联之前，将？!110(3基团用仲胺，优选呱啶切割。用于结合到去保护的4-(2'，4'-二甲氧苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂的优选方法为在DMF中的O-苯并三唑-l-基-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，1当量)、二异丙基乙胺(DIEA，1当量)，和任选1-羟基苯并三唑(H0BT，1当量)。保护氨基酸的连续偶联可以本领域众所周知的常规方式在全自动多肽合成仪上进行。从正在生成的a-N-末端移走Fmoc保护基团传统上是通过，例如仲胺，优选呱啶处理来完成的。导入约三倍摩尔过量的每种被保护的氨基酸，偶联优选在DMF中进行。偶联剂通常是0-苯并三唑-1-基-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，1当量)、二异丙基乙胺(DIEA，1当量)和任选1-羟基苯并三唑(H0BT，1当量)。在固相合成结束后，将肽从树脂上移走然后去保护，连续性操作或单独操作皆可。多肽的移去和去保护可用传统的单独操作完成，即用含苯硫基甲烷、三异丙基硅烷、苯酚和三氟乙酸的切割试剂处理树脂结合的多肽。在多肽的a-C-末端为烷基酰胺时，树脂用烷基胺进行氨解切割。或者，肽可以例如用甲醇，通过酯交换作用被移走，接着通过氨解或者直接转酰氨基作用进行。被保护的肽可以在这点上被纯化或者直接进入下一个步骤。侧链保护基团的移去通过上述的切割混合物来完成。完全去保护的肽的纯化通过色谱步骤顺序采用任何或者所有下列类型进行在弱碱性树脂上的离子交换(醋酸盐的形式)；在未衍生化的聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如AmberliteXAD)上的疏水吸附色谱；硅胶吸附色谱；在羧甲基纤维素上的离子交换色谱；例如在S印hadexG_25TM，LH-20上的分配色谱，或反流分布法；高效液相色谱法(HPLC)，特别是在辛基_或十八烷基甲硅烷基_二氧化硅键合相柱填充物上的反相HPLC。任何本领域的普通技术人员将能容易地确定什么是获得可接受的提纯GRF肽所要求的优选色谱步骤和顺序。用四极电喷雾(QuadrupoleElectroSpray)质谱确定这些肽的分子量。用于生产本发明GRF衍生物的合成过程变化很广泛，依赖于各种因素的性质，即GRF衍生物中所含的GRF序列、连接基团和反应实体。为了确保简化、高产和可重复性以及保证高纯度的产物，对合成程序加以选择。正常情况下，在合成的最后阶段，使化学反应基团偶联。用于生产本发明GRF衍生物的特别方法在下面描述。必须将化学反应实体放在一个位点上，以使肽结合到血液组分上，同时保持原始GRF肽的主要部分，如果不是全部的话，活性和/或有益效果。在一个更优选的实施方案中，每种GRF衍生物的合成将根据下列标准进行如果末端羧基对于肽是合适的，而且对于保持药理活性是不重要的，以及在肽上没有其它的敏感官能团，那么羧酸就被选作连接位点用于连接基团_反应实体修饰。如果末端羧基参与药理活性，或者没有合适的羧酸，那么，任何其它的对于保持药理活性不重要的敏感官能团将被选择作为连接位点用于连接基团_反应实体的修饰。如果肽上有若干敏感官能团是合适的，将使用保护基团的组合，其使用方式是在加入连接基团/反应实体并对所有被保护的敏感官能团去保护后，依然能够保留药理活性。如果肽上没有合适的敏感官能团，应该试图进行合成以对原始肽进行修饰，采用的方式是保留生物活性和保留受体或靶的特异性。在这种情况下，修饰应优选发生在肽的相对末端。本发明GRF衍生物可以单独使用也可以与其它的药物或药用产品结合使用以使得它们的治疗效果最优化。它们可以生理条件下可接受的介质给药，例如，去离子水、磷酸盐缓冲液(PBS)、盐水、含水乙醇或其它醇类、血浆、拟蛋白质(proteinaceous)溶液、甘露醇、含水葡萄糖、醇、植物油等。其它可能含有的添加剂包括缓冲液，其中介质缓冲液的pH范围通常大约为5到IO，缓冲液浓度一般是约50到250mM;盐，其中盐的浓度范围一般是约5到500mM，生理上可接受的稳定剂等。为了方便储存和运输，组合物可以被冻干。本发明肽衍生物可以通过口服、肠胃外给药，例如血管内(IV)、动脉内(IA)、肌内(IM)、皮下(SC)等方式给药。在合适的情况下，可以通过输液的方式给药。一些情况下，官能团的反应相对较慢，给药可以通过口服、鼻、直肠、经皮、气雾剂进行，其中结合物的特性容许转运到血管系统。虽然如果需要可以使用多于一次注射，但一般采用单次注射。可以用任何传统的方式给药肽衍生物，包括注射、套针、导管等。给药的特殊方式可以根据给药量是单次推注给药还是连续给药等而变化。优选的给药方式为血管内，导入的位点对于本发明不重要，优选的位点是该位点血流速度快，例如静脉内、外围或中央静脉。也发现了其它的途径，给药与缓释技术或者保护性基质结合。为了能够与血液组分反应，目的是肽可被有效地分配到血液中。结合物的浓度变化很大，一般范围是从大约lpg/ml到50mg/ml。血管内的总给药量一般范围是从大约0.lmg/ml到大约10mg/ml，更普遍的是从大约lmg/ml到大约5mg/ml。通过结合到血液中的长寿成分，例如免疫球蛋白、血清白蛋白、红细胞和血小板，结果产生很多优点。本发明肽衍生物的活性持续数天，有可能持续长达几星期。在这段时间内只需要一次给药。能够得到更大的特异性，因为活性化合物主要结合在大分子上，不大可能被细胞内吸收来参与其它的生理过程。可对哺乳动物宿主的血液中肽的活性和/或肽衍生物的存在进行监测。通过在不同的时间采集宿主血液的部分或样品，人们可以确定肽是否已经以治疗活性的足够量结合到长寿的血液成分上，以及其后血液中肽的水平。如果需要，人们也可以确定肽共价结合到哪一种血液组分。对于特异性马来酰亚胺取代的肽，仅仅需要简单计算血清白蛋白和IgG的半衰期。也可利用检测肽的活性，HPLC-MS或针对肽的抗体进行监测。本发明的另一方面涉及利用特异于本发明肽的抗体确定在生物样品(如血液)中GRF肽或其结合物的浓度的方法，和涉及以这样的抗体作为一种治疗方法用于治疗与这样的肽或结合物可能有关的毒性。这是有利的，因为在病人体内GRF衍生物延长的存在和寿命可能导致在治疗中新的问题出现，包括毒性有可能增加。通过利用对特殊衍生物具有特异性的单克隆或多克隆的"抗衍生物"抗体可以帮助调节任何这样的问题。该抗体可能产生或来源于一宿主，该宿主被特殊修饰的肽，或药物的免疫原性片段，或对应于药物的抗原决定簇的合成的免疫原免疫。优选的抗体应该对该肽衍生物的天然、衍生和结合形式具有高的特异性和亲合性。这样的抗体还可以被酶、荧光染料或放射性标记标记。特异于GRF衍生物的抗体可以通过使用纯化的肽诱导衍生的肽特异抗体来产生。通过诱导抗体，其目的不仅是通过注射动物剌激免疫反应，而且是类似的步骤生产合成抗体或其他特异性结合分子，例如筛选重组免疫球蛋白文库。单克隆和多克隆的抗体可以通过本领域公知的程序来生产。该抗体也可以用来监控衍生物在血流中的存在。血液和/或血清样品可以通过SDS-PAGE和western印迹进行分析。这些技术可以用来分析血液或血清以便确定该GRF衍生物和血液组分的结合。该抗治疗剂抗体也可以用来治疗由该GRF衍生物给药诱导的毒性，并可能被用在离体或体内。离体方法包括使用被固定到固相支持物上的抗治疗剂抗体免疫透析治疗毒性。体内方法包括给药抗治疗剂抗体，其量足以有效地诱导抗体药物复合物的清除。通过在无菌的条件下将血液与抗体接触，该抗体可用来在离体从病人的血液除去GRF衍生物及其结合物。例如抗体可以被固定在一柱基质上，然后从病人身上移出血液，并通过该基质。该GRF衍生物将与该抗体结合，然后含低浓度该GRF衍生物的血液可以被返回到该病人的循环系统。除去的GRF衍生物的量可以通过调节压力和流速而得到控制。从一病人血液的血浆组分优选移去该GRF衍生物可以实现，例如，通过利用半透膜，或者另外在将血浆组分通过含抗治疗抗体的基质之前首先以本领域公知的方法从细胞组分分离血浆组分。或者，优选移出衍生物结合的包括红血球的血细胞可以实现，即通过收集和浓縮病人血液中的血细胞并将这些细胞与固定的抗肽抗体接触以排除病人血液的血清组分。该抗肽抗体可以体内肠胃外被给药到一接受了GRF衍生物或结合物治疗的病人。抗体将结合GRF衍生物和结合物。一旦结合，如果不是完全封闭，该GRF衍生物活性将被阻碍，从而减少GRF衍生物在该病人血流中的生物有效浓度，并将有害的副作用降至最小。另外，该结合抗体_肽复合体将促进GRF衍生物和结合物从该病人血流中清除。提供下列实施例以阐明本发明的优选实施方案，并决不被看作是限制其范围。除非另外指出，采用L-构型光学活性保护的氨基酸。合成在产生GRF衍生物过程中，GRF衍生物的合成是在Symphony肽合成仪上利用全自动固相程序并在人工介入下进行的。合成是利用Fmoc-保护的氨基酸在Fmoc保护的RamageTM酰胺接头树脂上进行。偶联的完成采用N，N-二甲基甲酰胺(匿F)溶液中的O-苯并三唑-1-基-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)作为激活剂混合物。Fmoc保护基利用20X的哌啶/DMF除去。必要时，Boc-保护的氨基酸被用在N末端，为了在肽从树脂上切割后产生游离的Na-末端。在合成中所用的全部氨基酸具有L-立体化学构型，除非另有说明。合成中使用Sigmacoted玻璃反应罐。实施例1Tyr_Ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser—Ala—Arg—Lys—Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met—Ser—Arg—COM^步骤1:固相肽的合成以100mol量级进行。下列保护的氨基酸按添加到树脂上Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Met_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc-Asn(Trt)_0H、Fmoc-Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_IIe_0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Ala-0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。它们溶解到N，N_二甲基甲酰胺(DMF)中，并且根据顺序，利用0-苯并三唑-l-基-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)激活。Fmoc保护基团的移去利用20%(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分钟(步骤1)来完成。最终的氨基酸的氨基利用0-苯并三唑-1-基-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)激活的乙酸而乙酰化。步骤2:利用85%TFA/5%TIS/5X苯硫基甲烷和5%苯酚从树脂上切割肽，然后用干冰冷的(0-4tOE^0进行沉降。粗肽收集在聚丙烯烧结的漏斗内，干燥，并重新溶解在40%乙腈的水(0.1%TFA)混合物中，然后冷冻干燥产生相应粗提物，用于纯化过程中。实施例2实施例1的GRF肽的长效衍生物Tyr_Ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Lys(MPA)_C0NH2步骤1:实施这个步骤如同上述实施例1，除了加到树脂上的第一个氨基酸为Fmoc_Lys(Aloc)_0H。步骤2:Lys(Aloc)基团的选择性去保护人工进行，并且通过用溶解在5mLc6h6:chci3(i:i):2.5%nmm(v:v):5%Ac0H(v:v)中的3当量Pd(pph3)4溶液处理树脂2小时完成。然后树脂用CHCl3(6x5mL)、20%Ac0H的DCM(6x5mL)、DCM(6x5mL)和DMF(6x5mL)洗涤。步骤3:该合成加入3-马来酰亚胺丙酸(MPA)而重新自动进行。每次偶联之间，树脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和异丙醇分别洗涤三次。18步骤4:利用85%TFA/5%TIS/5X苯硫基甲烷和5%苯酚将衍生物从使用的树脂上切割，然后通过干冰冷的(0-4tOE^0进行沉降。粗衍生物收集在一聚丙烯烧结的漏斗中，干燥，重新溶解在40%乙腈的水(0.1%TFA)混合物中，冷冻干燥产生相应的粗GRF衍生物，用于纯化过程中。实施例3Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu—Ser—Ala—Arg—Lys—Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met—Ser—Arg—CONI^步骤1:固相肽的合成以100i！mole量级进行。下列被保护的氨基酸按序以实施例1的步骤1中所述的程序加到树脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-MetOH、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-Tyr(tBu)~0H。步骤2:该步骤的实施方式与实施例1的步骤2相同。实施例4实施例3的GRF肽的长效衍生物Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Ser_Arg_Lys(MPA)_C0NH2步骤1:这个步骤的操作如同实施例3，除了加到树脂上的第一个氨基酸为Fmoc_Lys(Aloc)_0H。步骤2-4:这些步骤的实施方式与实施例2的步骤2-4相同。实施例5Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_CONH2步骤1:固相肽的合成以100mole量级进行。下列被保护的氨基酸按序以实施例1的步骤1所述的程序加到树脂上Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Ser(tBu)-0H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala_0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。步骤2:该步骤的实施方式与实施例1的步骤2相同。实施例6实施例5的GRF肽的长效衍生物Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_Lys(MPA)_C0NH2《鍋奪篤+—第胡T都树瞎呢丄魏'6歸躯笼留fl^^翁胡凝4+pT凝率"8U)]2腦3_(VdW)s斗3JV-J:9s-ri9i—9ii—dsv-ui3-朋i—ri9i—s斗Sj:v-Biv-J9S-n9i—ui3-BIV_n9i_iBA_(sXi(9讽—N))—3jv—JX丄一J9s—ui3—Jq丄一9qd—9II—Biv—dsv—BlB(a)[Oslo]蹄帀级膽4胡难邏3胡6歸躯笼[e丄m]0T歸躯笼[8"0]°留继z凝率胡T歸躯笼封￥《躯笼胡凝4资z凝率["lo]°H0-(顺)^丄—3og、H0-可V(CI)-測d、H0-(顺)dsv-測d、H0』IV-測d、H0-3II-測d、H0-叫d-測d、H0_(顺)Jq丄-測d、H0—(lJ丄)ui9—3ouij、H0(ngi)J3S—3ouij、ho_(ngi)JX丄—3ouij、H0—(jqd)3JV—3ouij、H0-(3og)s人i一3ouy、H0_I13A_3ouy、朋_朋1_測3、H0-可V-測d、H0-(W)ui9-測d、H0-朋l-測d、H0-(顺H3S-測d、H0-可V-測d、H0-(jqd)3JV-測d、H0-(，)s人i—測j、H0-nai-測d、H0-nai-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0_(顺)dsv-測d、H0-3II-測d、H0-n3l-3ouy、H0_(ng"j9S_30uy、H0_(jqd)3jV_3ouy:T都树瞎呢谢虽胡彩巡T凝4胡T歸躯笼ra^凝鍋奪篤胡^掛魂「^土。^薪游暮rtootra掛导胡难继留t凝率[g"o]3腦3-S牛J9S-n9i—9ii—dsv-ui3-朋i—ri9i—s斗Sj:v-T3iv-J^s-ri9i—ui3-BIV_n9i_iBA_(sXi(9讽—N))—3jv—JA丄一J9S—ui3—Jq丄一9qd—9II—Biv—dsv—BiB(a)-JX丄l0]6歸躯笼°留继卜z凝率胡z歸躯笼封￥《躯笼胡凝4短班卜z凝4[s"o]°H0-(30IV)sAi-。ouy《鍋奪篤m]小一第胡T^树瞎呢丄魏'丄歸躯笼留顷#翁胡凝4+班T凝4""o]2腦3_(VdW)s斗3"iV-J:9s-ri9i—9ii—dsv-ui3-朋i—ri9i—s斗Sj:v-Biv-J9S-n91—ui3-可V-朋l-IT3A-"l-3JV(a)-^丄-i9S-ui3-Jq丄-3iH-3II-可V-dsV-T3IV(a)-^丄[OdO]蹄帀级膽4胡难邏3胡z歸躯笼[egm]8歸躯笼[89m]°留继z凝率胡T歸躯笼封￥《躯笼胡凝4资z凝率[am]°H0-(顺)^丄—3og、H0-可V(a)-測d、H0-(顺)dsv-測d、H0』IV-測d、H0-3II-測d、H0-叫d-測d、H0_(顺)Jq丄-測d、H0—(^j丄)ui9—3ouy、H0_(ngi)J3S_3ouy、H0_(ngi)JX丄—oouy、ho_(jqd)3』v(a)_3ouy、H0-(3og)"l-測d、H0-IT3A-測d、H0-nai-測d、H0』IV-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0-朋l-測d、H0-(顺H3S-測d、H0-可V-測d、H0-(jqd)3JV-測d、H0-(，)s人i—測j、H0-nai-測d、H0-nai-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0_(顺)dsv-測d、H0-3II-測d、H0-n3l-3ouy、H0_(ng"j9S_30uy、H0_(jqd)3jV_3ouy:T都树瞎呢谢虽胡彩巡T凝4胡T歸躯笼ra^凝鍋奪篤胡^掛魂「^土。^薪游暮9iorartootra掛导胡难继留t凝率[ggm]加03』牛"S-朋i—9ii—dsv-ui3-朋i—ri9i—s斗Sj:v-Biv-"S-n91—ui3-T3IV-n31-IT3A-sXl-SJV(a)-JXi-Jss-uig-Jqi-sqd-^II-T3IV-dsV—13113(d)-"丄[S9m]丄歸躯笼°留继卜Z凝率胡Z歸躯笼封￥《躯笼胡凝4短班卜Z凝率[S9U)]。H0-(3。IV)"l-測d《鍋奪篤+—第胡T都树瞎呢丄魏'S歸躯笼留fl^^翁胡凝4+PT凝率["l0]乐的说V0W969而N3Fmoc_Lys(Aloc)_0H。步骤2-4:这些步骤的实施方式与实施例2的步骤2-4相同。实施例11实施例9的GRF肽的第二种长效衍生物Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys(MPA)_Val_Leu_Ala_Gln—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys—Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Leu—Ser—Arg—C0NH2步骤1:固相肽的合成以100mole量级进行。下列被保护的氨基酸按序以实施例1的步骤1所述的程序加到树脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc_Ile_OH、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Lys(Boc)_OH、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_OH、Fmoc_Ala_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Aloe)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)Ala_0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。步骤2-4:这些步骤的实施方式与实施例2的步骤2-4相同。实施例12(牛GRF)Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Asn_Arg_CONH2步骤1:固相肽的合成以100mole量级进行。下列被保护的氨基酸按序以实施例1的步骤1所述的程序加到树脂上Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Asn(Trt)-0H、Fmoc-Met-OH、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala_0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。步骤2:该步骤的实施方式与实施例1的步骤2相同。实施例13实施例12的GRF肽的长效衍生物Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Ser_Asn_Lys(MPA)_C0NH2步骤1:这个步骤的操作如同实施例12，除了加到树脂上的第一个氨基酸为Fmoc_Lys(Aloc)_0H。步骤2-4:这些步骤的实施方式与实施例2的步骤2-4相同。实施例14(牛GRF)Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_CONH2步骤1:固相肽的合成以100mole量级进行。下列被保护的氨基酸按序以实施例1的步骤1所述的程序加到树脂上Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Asn(Trt)-0H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。步骤2:该步骤的实施方式与实施例1的步骤2相同。实施例14实施例13的GRF肽的长效衍生物Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_Lys(AEEA_MPA)_C0NH2步骤1:这个步骤的操作如同实施例13，除了加到树脂上的第一个氨基酸为Fmoc_Lys(Aloc)_0H。步骤2:Lys(Aloc)基团的选择性去保护人工进行，并且通过用溶解在5mLc6h6:chci3(i:i):2.5%nmm(v:v):5%Ac0H(v:v)的3当量Pd(pph》4溶液处理树脂2小时(步骤2)完成。然后树脂用CHCl3(6x5mL)、20%Ac0H的DCM(6x5mL)、DCM(6x5mL)和DMF(6x5mL)洗涤。步骤3:该合成然后加入Fmoc-AEEA-OH(Fmoc-氨基乙氧基乙氧基醋酸)而重新自动进行。每次偶联之间，树脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和异丙醇分别洗涤三次。在正确去保护后，MPA(3-马来酰亚胺丙酸)被固定在AEEA间隔区，然后树脂再用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和异丙醇分别洗涤三次。步骤4:利用85%TFA/5%TIS/5X苯硫基甲烷和5%苯酚将衍生物从使用的树脂上切割，然后通过干冰冷的(0-4tOE^0进行沉降。粗衍生物收集在一聚丙烯烧结的漏斗，干燥，重新溶解在40%乙腈的水(0.1%TFA)混合物中，冷冻干燥产生相应的粗GRF衍生物，用于纯化过程中。实施例15(牛GRF)Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_(D)arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_CONH2步骤1:固相肽的合成以100i！mole量级进行。下列被保护的氨基酸按序以实施例1的步骤1所述的程序加到树脂上Fmoc-Arg(Pbf)-0H、Fmoc-Asn(Trt)-0H、Fmoc-Leu-0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Val_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_(D)arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Thr(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala_0H、Boc-Tyr(tBu)_0H。步骤2:该步骤的实施方式与实施例1的步骤2相同。实施例16实施例15的GRF肽的长效衍生物s丫H(dffi)専顆)OZ歸躯笼[l"o]°留继，-z凝率胡z歸躯笼封￥《躯笼胡凝4短班卜z凝4[o"o]°H0-(顺)^丄—3og、H0-平(a)-測d、H0-(顺)dsv-測d、H0』IV-測d、H0-3II-測d、H0-叫d-測d、HO_(顺)Jq丄-測d、H0—(lJ丄)ui9—3ouij、H0—(ngi)J3S—3ouij、H0_(ngi)JX丄—3ouij、H0—(jqd)3JV—3ouij、H0-(3oiv)"l-測d、H0-IT3A-扁d、H0-nai-扁d、H0』IV-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0-n3i-測d、H0-(顺)"S-測d、H0-可V-測d、H0-(jqd)3牛30叫、H0-(308)"l-測d、H0-nai-測d、H0-nai-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0_(顺)dsv-測d、H0-3II-測d、H0-n3l-3ouy、H0—(w丄)usy—3ouy、H0_(jqd)3jV_3ouy:T都树瞎呢谢虽胡彩巡T凝4胡T歸躯笼ra^凝鍋奪篤胡^掛魂「^土。^薪游暮rtootra掛导胡难继留t凝率[e^o]加03』牛usv-ri9i—9ii—dsv-ui3-朋i—ri9i—s斗Sj:v-Biv-"S-n9i—ui"IV-^l-H(VdW)sXi—Sjv-^—jss-uig-m-siH-^II-BIV-dsV-BI13(d)-"丄[8"0]蹄审级狻4扭二第胡难邏3胡丄T歸躯笼["z0]6T歸躯笼[9w0]°留继，-z凝率胡z歸躯笼封￥《躯笼胡凝4短班卜z凝4[swo]。H0-(3。IV)"l-測d《鍋奪篤+—第胡T都树瞎呢丄魏'丄T歸躯笼留贿#翁胡凝率+班T凝率[^浏蹄帀级膽4胡难邏3胡丄T歸躯笼[zwo]8T歸躯笼[lwo]°留继Z凝率胡T歸躯笼封￥《躯笼胡凝4资Z凝率°H0-(顺)^丄—3og、H0-平(a)-測d、H0-(顺)dsv-測d、H0』IV-測d、H0-3II-測d、H0-叫d-測d、H0_(顺)Jq丄-測d、H0—(lJ丄)ui9—3ouij、H0(ngi)J3S—3ouij、ho_(ngi)JX丄—3ouij、H0—(jqd)3JV—3ouij、H0-(3og)s人i一3ouy、H0_I13A_3ouy、朋_朋1_測3、H0-可V-測d、H0-(W)ui9-測d、H0-朋l-測d、H0-(顺H3S-測d、H0-可V-測d、H0-(jqd)3JV-測d、H0-(，)s人i—測j、H0-nai-測d、H0-nai-測d、H0_(W丄)ui9-測d、H0_(顺)dsv-測d、H0-3II-測d、H0-n3l-3ouy、H0—(w丄)usy—3ouy、H0_(jqd)3jV_3ouy:T都树瞎呢谢虽胡彩巡T凝4胡T歸躯笼ra^凝鍋奪篤胡^掛魂「^土。^薪游暮rtootra掛导胡难继留t凝率[e^o]3腦3』牛usV-n31-3II-dsV-ui9-n31-n31-s斗^V-可V-"S-n91-1119-13IV_n9i_iBA_(sXi(9讽—N))—3jv—JX丄一J9s—ui3—Jq丄一9qd—9II—Biv—dsv—BiB(a)-JX丄[8^0](邏3+ut歸躯笼[abo]°留继卜z凝率胡w歸躯笼封￥《躯笼胡凝4短班卜z凝4[9^0]。H0-(3。IV)"l-測d《鍋奪篤+—第胡T都树瞎呢丄魏'ST歸躯笼留fl^^翁胡凝率+PT凝率[sbo]2腦3_(VdW_V33V)sXl_Sj:v_usv_ri3i_3ii_dsv_ui3_n3i_ri3i_sXi_Sj:v_T3iv_J^s_ri3i_ui3-T3IV-n31-IT3A-sXl-SjB(a)-jXi-jss-uig-Jqi-sqd-^II-BIV-dsV-BI13(d)-"丄[wzo]u-Ser-Al3-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys-C0NH2步骤1:固相肽的合成以100mole量级进行。下列被保护的氨基酸按序以实施例1的步骤1所述的程序加到树脂上Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Met-0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc-His(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Tyr(tBu)0H、Fmoc_Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Met_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-His(Boc)_0H。步骤2:该步骤的实施方式与实施例1的步骤2相同。实施例21实施例20的GRF肽的长效衍生物His-(D)ala_Asp_Gly_Met_Phe_Asn_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys_Ala_Leu_Gly_Gln_Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys(AEEA-MPA)_C0NH2步骤1:该步骤的实施如同实施例20。步骤2-4:这些步骤的实施方式与实施例14的步骤2-4相同。实施例22(鲑鱼GRF)实施例20的GRF肽的第二种长效衍生物His-(D)ala_Asp_Gly_Met_Phe_Asn_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys(MPA)_Ala_Leu_Gly_Gln-Leu-Ser-Al3-Arg-Lys-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Al3-Lys-C0NH2步骤1:固相肽的合成以100mole量级进行。下列被保护的氨基酸按序以实施例1的步骤1所述的程序加到树脂上Fmoc-Lys(Boc)-0H、Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Met-0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc-His(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Lys(Boc)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Aloe)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Met_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-His(Boc)_0H。步骤2-4:这些步骤的实施方式与实施例2的步骤2-4相同。实施例23(鸡GRF)His-(D)ala_Asp_Gly_Ile_Phe_Ser_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys_Leu_Leu_Gly_Gln_Leu—Ser—Ala—Arg—Asn—Tyr—Leu—His—Ser—Leu—Met—Ala—Lys—CONI^步骤1:固相肽的合成以100mole量级进行。下列被保护的氨基酸按序以实施例1的步骤1所述的程序加到树脂上Fmoc-Lys(Boc)-0H、Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Met-0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc-His(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Tyr(tBu)0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc—Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-His(Boc)_0H。步骤2:该步骤的实施方式与实施例1的步骤2相同。实施例24实施例23的GRF肽的长效衍生物His_(D)ala_Asp_Gly_Ile_Phe_Ser_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys_Leu_Leu_Gly_Gln_Leu-Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Ala-Lys(AEEA-MPA)_C0NH2步骤1:该步骤的实施如同实施例23。步骤2-4:这些步骤的实施方式与实施例14的步骤2-4相同。实施例25实施例23的GRF肽的第二种长效衍生物His-(D)ala_Asp_Gly_Ile_Phe_Ser_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys(MPA)_Leu_Leu_Gly_Gln-Leu-Ser-Al3-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-Al3-Lys-C0NH2步骤1:固相肽的合成以100mole量级进行。下列被保护的氨基酸按序以实施例1的步骤1所述的程序加到树脂上Fmoc-Lys(Boc)-0H、Fmoc-Ala-0H、Fmoc-Met-0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc-His(Trt)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Tyr(tBu)0H、Fmoc_Asn(Trt)_0H、Fmoc-Arg(Pbf)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Gln(Trt)_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc_Leu_0H、Fmoc-Lys(Aloe)_0H、Fmoc_Arg(Pbf)_0H、Fmoc-Tyr(tBu)_0H、Fmoc_Ala_0H、Fmoc-Lys(Boc)_0H、Fmoc_Ser(tBu)_0H、Fmoc_Phe_0H、Fmoc_Ile_0H、Fmoc_Gly_0H、Fmoc-Asp(tBu)_0H、Fmoc_(D)ala-0H、Boc-His(Boc)_0H。步骤2-4:这些步骤的实施方式与实施例2的步骤2-4相同。实施例26实施例1的GRF肽的第二种长效衍生物(N-MPA)_Tyr_Ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln—Leu—Ser—Ala—Arg—Lys—Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Met—Ser—Arg—C0NH2步骤1:该步骤的实施如同上述实施例1，除了在合成结束时，将最后的组分(MPA)加入到树脂中。步骤2:利用85%TFA/5%TIS/5X苯硫基甲烷和5%苯酚将衍生物从使用的树脂上切割，然后通过干冰冷的(0-4tOE^0进行沉降。粗衍生物收集在一聚丙烯烧结的漏斗，干燥，重新溶解在40%乙腈的水(0.1%TFA)混合物中，冷冻干燥产生相应的粗GRF衍生物，用于纯化过程中。实施例27实施例1的GRF肽的第三种长效衍生物(N-AEEA_MPA)_Tyr_Ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Ser_Arg_CONH2步骤1:这个步骤的操作如同上述实施例1，除了加到树脂上的倒数第二个组分为Fmoc-AEEA，以及最后的组分为(MPA)。步骤2:该步骤以及与实施例26的步骤2相同。纯化程序利用Varian(Dynamax)制备性二元HPLC系统，通过制备性反相HPLC纯化每个化合物。用PhenomenexLuna10ii苯基-己基，50mmx250mm柱(颗粒10ii)进行纯化，柱用水/TFA混合物(0.1%TFA的水(溶剂A)和乙腈/TFA(0.1%TFA的CH3CN(溶剂B)平衡。以50mL/min运行28-38%B梯度180分钟完成洗脱。通过在214和254mm处的UV吸光度(VarianDynamaxUVDII)检测含有肽的组分。以25mL等分收集组分。那些含有目的产物的组分在直接注射到LC/MS后通过质量检测进行鉴定。选择的组分随后通过HPLC(20-60%B运行20分钟；PhenomenexLuna5y苯基-己基，10mmx250mm柱，0.5mL/min)分析鉴定，并把^90%纯度的组分合并。用液氮对合并物冻干，然后冻干至少2天以产生白色粉末。体外结果—些本发明GRF衍生物经评估具有显著促进GH在大鼠初级前脑垂体细胞培养物中分泌的能力。将新鲜的大鼠前脑垂体细胞与不同浓度的化合物接触4小时，然后用市售的LincoResearch(MO)的RIA试剂盒检测培养基中的GH水平。方法从麻醉的正常Sprague-Dawley大鼠移去全部脑垂体，直接收集到含两性霉素和庆大霉素硫酸盐的新鲜培养基中。脑垂体收集后l小时内的细胞用于制备初级细胞。把单个脑垂体切碎，组织碎片在持续温和搅拌下用胰蛋白酶进行降解。组织碎片经巴斯德移液管机械破碎后再温育15分钟。研磨细胞，洗涤两次，然后接种到含新鲜培养基的24孔板中。培养72小时后，细胞用不含血清的培养基洗涤两次，然后用含或不含GRF类似物或衍生物温育4小时。温育后收集上清，并用放射免疫测定法定量检测大鼠生长激素(试剂盒购自LincoResearch,MO)。如图中所示，结果显示所有本发明GRF衍生物都能刺激GH分泌，浓度范围是10_6到10—,之间。刺激指数等同于市售的GRF(l-29)和D-Ala-GRF(l-29)(两者皆来自PolypeptideLaboratories,California)。体内结果本发明GRF衍生物的体内活力经评估具有显著促进自由活动的动物GH分泌的能力。化合物通过皮下浓注(liimol/kg)到插有导管的标准Sprague-Dawley大鼠进行给药。收集连续的血液样品来测定给药化合物后的急性GH释放。方法插入导管的7-8周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠在实验前至少5天安装鼠具以避免应激。实验只在上午9-ll之间开始。每个处理组由8只大鼠组成。化合物通过皮下注射到腰背区的方式给药1次。在注射后5、10、15、20、30和60分钟时以前剂量采集系列血液样品。收集血浆，然后将样品直接送到LincoResearch(MO)，通过放射免疫测定GH。用MicrosoftExcel软件进行统计分析(t_检验)。如图中所示，结果显示所有本发明GRF衍生物都能诱导标准大鼠模型分泌GH。药代动力学研究对于实施例5和6的化合物进行药代动力学研究。每种化合物皮下(1ymol/kg)或静脉内(100nmol/kg)注射到雄性Sprague-Dawley大鼠体内。在药物注射后5、30和60分钟以及2、4、8、24、48、72和96小时以前剂量采集系列血液样品。收集血浆并冷冻直至放26射免疫测定(RIA)进行分析。市售的抗原始GRF(l-29)的多克隆抗体被用来检测化合物。检测灵敏度为300到10000pM。所以，一些样品必须稀释后分析。药代动力学图谱的结果显示于图9。正如所见，实施例5的化合物即原始肽，消失得非常快。实际上，实施例5的化合物无论是皮下还是静脉内给药在给药后60分钟都不能检测到。这与文献中报告的有关GRF(l-29)及其它类似物在Sprague-Dawley大鼠中的半衰期和生物可利用率百分比(SC/IV)的结果吻合(参见例如P印tides，9:207-209，和J.Endocr.，107:R5-R8。另外，实施例6的化合物，根据本发明它是实施例5原始肽的衍生物，在96小时后仍可检测到。附加的数据显示在下列表2中。表2实施例6化合物的药代动力学参数<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>尽管本发明结合特定的实施方案得已描述，但是可以理解其能被进一步的修饰，并且本申请意欲覆盖遵循本发明一般原理，包括偏离本发明说明书但属于本发明所属
技术领域：
内已知或惯用的做法，和可应用于上文所述的必要特征以及落入所附权利要求的范围之中的任意变化、使用或改编。权利要求1.一种生长激素释放因子衍生物，其含有-如下GRF序列A「A2-Asp-A4-A5-Phe-A厂A8-A9-Tyr-An-Ai2-Ai3-leu-Ai5-Gln-Leu-Ai8-Ala-A2o-A2「A22-Le^_八24_八25_八26_八27_八28_八29_八30其中，Ai为Tyr、N_Ac_Tyr、His、3-MeHis、脱氨基His、脱氨基Tyr、Lys-Tyr、Lys-His或Lys_3_MeHis;A2为Val、Leu、Ile、D_Ala、N-甲基—D—Ala、(N_甲基)Ala、Gly、Nle或Nval;A4为Ala或Gly;A5为Met或lie;A7为Asn、Ser或Thr;A8为Asn、Gln、Lys或Ser;A9为Ala或Ser;An为Arg、D-Arg、Lys或D-Lys;A12为Lys、(N-Me)Lys、Lys或D-Lys;A13为Val或Leu;A15为Ala、Leu或Gly;A18为Ser或Thr;A20为Arg、D-Arg、Lys或D-Lys;A21为Lys、(N_Me)Lys或Asn;A22为Tyr或Leu;A24为Gin或His;A25为Ser或Asp;A26为Leu或lie;A27为Met、Ile、Leu或Nle;A28为Ser、Asn、Ala或Asp;A29为Lys或Arg;以及A30为缺失、X或X-Lys，其中X缺失或者是序列Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其片段，其中片段从C末端减少1到15个氨基酸；以及其中片段的一个氨基酸残基可被赖氨酸残基任选取代；并且其中C末端可以是游离的羧酸或相应的酰胺，其中GRF衍生物能够促进生长激素产生和/或释放活性；以及-任选经连接基偶联到GRF肽上的反应实体，其中的反应实体是含马来酰亚胺的基团，所述反应实体能够在体内或体外与血液组分上的官能团共价结合。2.—种结合物，其包括与血液组分共价结合的如权利要求1所述的衍生物。3.如权利要求1或2所述的衍生物或结合物，其中血液组分包括白蛋白。4.如权利要求1至3任一项所述的衍生物或结合物，其中血液组分为人白蛋白。5.如权利要求4所述的衍生物，其中衍生物的反应基团能够共价结合白蛋白的位于氨基酸残基Cys34上的巯基。6.如权利要求4所述的结合物，其中衍生物的反应基团能够共价结合白蛋白的位于氨基酸残基Cys34上的巯基。7.如权利要求1至6任一项所述的衍生物或结合物，其中含马来酰亚胺的基团的马来酰亚胺是Y-马来酰亚胺-丁酰酰胺(GMBA)或马来酰亚胺丙酸(MPA)。8.如权利要求7所述的衍生物或结合物，其中反应实体直接或经连接基连接到肽上。9.如权利要求8所述的衍生物或结合物，其中含马来酰亚胺的基团以及连接基选自与AEA，EDA或AEEA的两个或者多个的组合连接的(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)-MPA、乙二胺(EDA)-MPA、[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)-MPA和MPA。10.如权利要求8所述的衍生物或结合物，其中的连接基选自直链或支链C卜w烷基；部分氟化或过氟化的直链或支链(V1Q烷基；C卜1Q烷基或氟烷基，其中一个或多个碳原子被0或S取代以形成醚或硫醚；o-、m-或p-二取代苯基，其中取代基相同或不同，并且为CH20、S、NH、NR，其中R为H、(V1Q烷基或C卜w酰基；或二取代杂环，如呋喃、噻吩、吡喃、唑或噻唑。11.如权利要求1至10任一项所述的衍生物或结合物，其中GRF序列选自Tyr_(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Ser_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_(D)Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_CONH2;Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-((N_Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Asn_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Met_Asn_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_(D)Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_CONH2;Tyr-(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-((N_Me)Lys)-Val-Leu-Ala-Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Asn_Arg_CONH2;Tyr_(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser—Ala—Arg—Lys—Leu—Leu—Gln—Asp—Ile—Leu—Ser—Arg—Lys—CONI^;His-(D)ala_Asp_Gly_Met_Phe_Asn_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys_Ala_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser_Ala_Arg_Lys_Tyr_Leu_His_Ser_Leu_Met_Ala_Lys_CONH2;禾口His-(D)ala_Asp_Gly_Ile_Phe_Ser_Lys_Ala_Tyr_Arg_Lys_Leu_Leu_Gly_Gln_Leu_Ser-Ala-Arg-Asn-Tyr-Leu-His-Ser-Leu-Met-AlEi-Lys-COM^;每个GRF序列在N末端或C末端任选含有赖氨酸残基并且其中的反应实体是含马来酰亚胺的基团。12.如权利要求11所述的衍生物或结合物，其中的GRF序列在C末端含有添加的赖氨酸残基。13.如权利要求12所述的衍生物或结合物，其中的衍生物选自Tyr_(D)ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser_Ala_Arg_Lys_Leu_Leu_Gln_Asp_Ile_Leu_Ser_Arg_Lys(MPA)_C0NH2;禾口Tyr_(D)ala_Asp_Ala_Ile_Phe_Thr_Gln_Ser_Tyr_Arg_Lys_Val_Leu_Ala_Gln_Leu_Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Lys(AEEA-MPA)_C0NH2。14.含有权利要求l，3-5或7-13任一项所述的衍生物连同可药用载体的药物组合物。15.含有权利要求2-4或6-13任一项所述的结合物连同可药用载体的药物组合物。16.权利要求14或15所述的组合物在制备用于促进受试者内源性产生或释放GH的药物中的应用。17.如权利要求14或15所述的组合物在制备用于治疗或预防由GH产生异常导致的疾病或症状的药物中的应用。18.用于延长具有生长激素释放活性的肽的体内半衰期的离体方法，该方法包括将权利要求l，3-5或7-13任一项所述的衍生物与人白蛋白共价结合。全文摘要文档编号A61K38/00GK101696240SQ20091016348公开日2010年4月21日申请日期2002年2月1日优先权日2001年2月2日发明者多米尼克·P·布赖顿,尼赛布·布杰拉布,科琳·邦盖,罗杰·莱杰,露西·热泰,马丁·罗比塔耶申请人:康久化学生物技术公司;