2F和2Y二聚体肽，D、E、F分别代表D、E、F单 体肽。
[0034] 图10是各种GHRH类似肽和二聚体肽的大鼠生长激素释放活性结果图；
[0035] 图11是各种GHRH类似肽和二聚体肽的大鼠体外ACTH激素释放活性结果图；
[0036] 图12是各种GHRH类似肽和二聚体肽的大鼠体外PRL激素释放活性结果图；
[0037] 图13是各种GHRH类似肽和二聚体肽的大鼠体外LH激素释放活性结果图；
[0038] 图14是生长激素释放抑制实验。在13-15孵育中，0.482或1.927yM的GHIH被 添加于1.927yM的GHRH类似物中。无肽的P2作为空白，S肽作为标准。统计学显著性 (*P〈0. 05或**P〈0. 01)通过比较不同剂量的一个GHRH二聚体在I3-I5孵育同一时间的数 据获得。
[0039] 图15是GHRH二聚体肽受体结合垂体匀浆的Scatchard图；
[0040] 图16是大鼠垂体组织（mag. 100X10倍）的GHRH受体荧光染色分析。FITC:FITC 标记的3、20、2￡、2?、2￥肽染色；04?1:核荧光染色"6找6(1^1'(：和04?1图像合并。黄色部 分表示细胞阳性；
[0041] 图17是2F组治疗雄性模型组睾丸组织H-E染色（放大倍数4X10);
[0042] 图18是2F组治疗雌性模型鼠卵巢组织切片H-E染色（放大倍数4X10);
[0043] 图19是FITC-hGHRH(l-44)NH』i^睾丸组织的荧光染色（放大倍数IOX10)。黄 色为FITC-hGHRH(l-44)NHji^B性荧光，蓝色为细胞核DAPI荧光；
[0044] 图20FITC-hGHRH(l-44)M〇^#卵巢组织的荧光染色（放大倍数4X10)。黄色为 FITC-hGHRH(l-44)NHji^性荧光，蓝色为细胞核DAPI荧光；
【具体实施方式】：
[0045] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0046] 实施例1 :新型生长激素释放激素类似物的合成：
[0047] 一、单体肽合成过程：手工化学固相多肽合成（SYMPHONY型12通道多肽合成仪，软 件版本Version. 201，ProteinTechnologiesInc.)，操作步骤：
[0048] 1、树脂溶涨：将大王树脂（wangresin，购自天津市南开合成科技有限公司）放入 反应锅中，加二氯甲烧（DCM，DikmaTechnologiesInc.) 15ml/g在大王树脂中，振荡30min。
[0049] 2、接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤除去溶剂，加入3毫摩尔的C端第一个Fmoc-AA 氨基酸（所有的Fmoc-氨基酸由苏州天马医药集团精细化学品有限公司提供），再加入10 毫摩尔量的4-二甲氨基吡啶（DMAP)和N，N'-二环己基碳二亚胺（DCC)，最后加入二甲基甲 酰胺（DMF)(购自DikmaTechnologiesInc.)溶解，振荡30min。用醋酸酐封闭。
[0050] 3、脱保护：去掉01^，加20%哌啶-01^溶液（151111/^)5111111，过滤去掉溶剂，再加 20%哌啶-01^溶液（151111/^)151^11(哌啶由国药集团上海化学试剂公司提供）。
[0051] 4、检测：在合成过程中，随机进行检测，以便监控合成是否顺利：抽掉溶剂，取十 几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮、KCN和苯酚溶液各一滴，105-110°C加热5min，变深 蓝色为阳性反应。
[0052] 5、洗树脂：依次加入DMF(IOmVg)洗两次，甲醇（lOml/g)洗两次，DMF(IOmVg)洗 两次。
[0053] 6、缩合：3毫摩尔的Fmoc-AA(从C端第二个氨基酸到N末端氨基酸）和3毫摩尔 的2-(7-偶氮苯并三氮唑）-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU，苏州天马医药集团精细化学品有 限公司），均用尽量少DMF溶解，加入反应锅中。立刻加入十倍量的N-甲基吗啉（NMM，苏州 天马医药集团精细化工有限公司），反应30min，检测呈阴性。
[0054] 7、洗树脂：依次DMF(IOmVg)洗一次，甲醇（lOml/g)洗两次，DMF(IOmVg)洗两 次。
[0055] 8、重复二至六步操作，如表1和2的氨基酸序列所示，从右到左依次连接相应氨基 酸。
[0056] 9、脱除最后Pro的FMOC保护基，检测呈阳性，溶液抽干备用。
[0057] 10、按照下列方法洗树脂，依次DMF(lOml/g)两次，甲醇（lOml/g)两次，DMFdOml/ g)两次，DCM(IOmVg)两次，IOmin抽干。
[0058]11、从树脂上切割多肽：配制切割液（10毫升/g):TFA94. 5 % (J.T.Baker ChemicalCompany)；水 2. 5 %,乙二硫酉享ethanedithiol(EDT,Sigma-Aldrich Chemistry)2.5 % 和三异丙基娃烧triisopropylsilane(TIS,Sigma-Aldrich Chemistry)l%。切割时间：120min。
[0059] 12、吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。
[0060] 13、用HPLC仪纯化多肽：将粗肽用纯水或者加少量乙腈溶解，按照下列条件纯化：
[0061] 高效液相色谱仪（制备型和分析型；软件Class-VP.SevialSystem;厂商日本 SHIMADZU)和VenusiMRC-ODSC18 色谱柱（30x250mm，天津Bonna-AgelaTechnologies)。 流动相A液：0. 1 %三氟乙酸水溶液，流动相B液：0. 1 %三氟醋酸-乙腈溶液（乙腈Fisher Scientific公司购买）。流速：1.Oml/min，上样体积30y1，检测波长220nm。洗脱程序： 0 ?5min:90%A液 +10%B液；5 ?30min梯度：90%A液 /10%B液一20%A液 /80%B 液。
[0062] 14、最后将纯化后的溶液冻干成粉末（冻干机FreezonePlus6型号，LABC0NC0产 品），即得到成品。
[0063] 15、鉴定：分别取少量的成品多肽，做ESIMS的分子量鉴定和C18-HPLC分析的纯 度鉴定。
[0064] 16、将粉末状的多肽，密封包装，-20度避光保存。
[0065] 二、二聚体肽的形成：当带有GGC的单体肽（表1所示的D肽、E肽、F肽、Y肽或 表2所示的D1肽、E1肽、F1肽、Y1肽）在0. 5mg/ml浓度下，在pH= 11. 5氨水溶液中，37°C 保温60小时，形成100%的二聚体肽2D、2E、2F、2Y或2DL、2EL、2FL、2YL等二聚体肽，它们的 SDS-PAGE图如图9所示。其氨基酸序列如表1和表2所示。
[0066] 三、肽种类：按照上述方法合成的11个GHRH类似单体肽（A-F、Y，D\E\FL、YL)、三 个1^11冊标准肽（51、52和521肽）和八个二聚体肽（20、2￡、2?、2￥，20 1、2￡1、2?1、2￥1肽）的 氨基酸序列如表1和2所示。Sl、S2、A-F、Y肽的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 1-9所示。 其HPLC纯度>95% (A-F以及Sl和S2肽的HPLC纯度鉴定图以及分子量鉴定图如图1-图 8所示）。它们FITC标记的肽如表2所示。Sl和S2被用作阳性对照。表1和2所示的所 有GHRH类似肽和hGHRH肽委托上海强耀生物科技有限公司合成。
[0067] 表I:GHRH类似肽、hGHRH肽和二聚体肽的氨基酸序列
【主权项】
1. 一类新型生长激素释放激素类似肽，其特征在于，所述的新型生长激素释放激素类 似肽为2D、2E、2F或2Y二聚体肽： 所述的2D二聚体肽的氨基酸序列为： (H)PPYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(OH)CGGLRARAGREQ NSEGQQRSMIDQLLKRASLQGLVKRYSNTFIADAY PP(H)； 所述的2E二聚体肽的氨基酸序列为： (H)PYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(OH)CGGLRARAGREQN SEGQQRSMIDQLLKRASLQGLVKRYSNTFIADAYP(H) 所述的2F二聚体肽的氨基酸序列为： (H)PADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(OH)CGGLRARAGREQNS EGQQRSMIDQLLKRASLQGLVKRYSNTFIADAP(H)； 所述的2Y二聚体肽的氨基酸序列为： (H)YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARLGGC(OH)-(OH)CGGLRARAGREQNS EGQQRSMIDQLLKRASLQGLVKRYSNTFIADAY(H)。
2. 权利要求1所述的新型生长激素释放激素类似肽2D、2E、2F或2Y二聚体肽在制备治 疗不孕不育药物中的应用。
3. -种治疗不孕不育药物，其特征在于，以权利要求1中所述的新型生长激素释放激 素类似肽2D、2E、2F或2Y二聚体肽作为活性成份。
【专利摘要】本发明公开了一类新型生长激素释放激素类似肽及其在制备治疗不孕不育药物中的应用。本发明通过实验发现，2D、2E或2F肽具有明显高的垂体GH释放活性和垂体激素释放特异性。经过体外GHRH二聚体肽和垂体GHRH受体结合反应测试，2D、2F和2E二聚体肽具有很高结合垂体受体活性，其中2F二聚体肽具有最大结合活性。以2F肽为代表，经不孕不育模型治疗发现，与生理盐水组和单纯环磷酰胺对照组比较，2F二聚体肽组的曲细精管中的精母细胞、精原细胞明显增生，曲细精管细胞排列整齐，体积变粗，曲细精管腔变小，甚至消失，呈现剂量依赖性。这些说明，以2F二聚体为代表的这类GHRH肽具有明显刺激精卵原细胞增殖和成熟作用，从而促进生殖，因此能够用于不孕不育药物。
【IPC分类】A61P15-08, C07K14-60, A61K38-25
【公开号】CN104558150
【申请号】CN201410612382
【发明人】唐松山, 张娟辉, 游娟, 张旭东, 周东, 李红枝, 李秋莹, 郭小元, 唐婧晅
【申请人】广东药学院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年11月4日