一种海洋盐单胞菌的分泌物及其提取方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海洋盐单胞菌的分泌物及其提取方法与应用。
【背景技术】
[0002] 近些年来海洋频繁地爆发甲藻藻花，而赤潮甲藻大多数产毒素，如溶血毒素 (hemolysin)，麻痹性贝毒（Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)，短裸甲藻毒素组毒素 (Brevetoxin-group，BTX)，不仅赤潮本身对海洋生态环境产生严重的后果，而且藻类产生 的这些毒素对海洋动物如鱼贝类都会产生巨大的危害，甚至威胁到人们的健康，因而受到 沿海国家的高度重视。从现有条件看，一旦大面积赤潮出现后，还没有特别有效的方法加以 制止，对于一些局部小范围防治赤潮的方法，虽实验过多种，但效果还不够理想。主要是利 用化学药物（硫酸铜）杀灭赤潮生物，但效果欠佳，费用昂贵，经济效益和环境效益均不太 好；有的采用网具捕捞赤潮生物，或采用隔离手段把养殖区保护起来等等。这些方法均在 实验中，还未取得较大的突破，从发展趋势看，生物控制法，即分离出对赤潮藻类合适的控 制生物，以调节海水中的富营养化环境将是较好的选择。但是在大海中，加抑藻物质抑制藻 种，必须有瞬间的杀藻效果，如果作用的时间一长，由于海水的稀释作用，很快将其稀释掉， 因此至今未能找到有效的抑制赤潮藻的物质。即便有些物质有此效果，但是由于其提取的 过程繁琐，费用高，无法在实践中应用。
【发明内容】
[0003] 本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种海洋盐单胞菌的分泌物及其提 取方法与应用，解决现有技术存在的问题。
[0004] 为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：一种海洋盐单胞菌的分泌物的提取 方法，包括以下步骤：
[0005] 步骤一，将培养基按照以下比例配制好：酵母粉5g、胰蛋白胨IOg和海水IL ;
[0006] 步骤二，将配置好的培养基在121°C灭菌15-20min ;
[0007] 步骤三，将海洋盐单胞菌在无菌条件下接种到培养基中，于25-30°C恒温120-150 转/min摇床上培养10-15天，细菌可充分的分泌代谢物；
[0008] 步骤四，用0. 22-0. 45 μ m的膜过滤、除菌得到细菌分泌液上清；
[0009] 步骤五，将得到的滤液真空冷冻干燥，再用纯的乙酸提取、滤纸过滤脱盐；
[0010] 步骤六，将得到的滤液挥干乙酸后得到海洋盐单胞菌的分泌物的粗体物，用超纯 水溶解得到粗提液。
[0011] 进一步地，步骤四所述的细菌分泌液上清OD267为1. 4-1. 6 ;步骤六所述的粗提液 OD267为 L 4-1. 6,浓度为 7. 0mg/mL。
[0012] 一种海洋盐单胞菌的分泌物的应用，主要是用来治理赤潮，对赤潮甲藻塔玛亚历 山大藻、东海原甲藻和米氏凯伦藻有明显的抑制作用，而对海洋中的一些无毒绿藻、硅藻和 蓝藻并没有抑制作用。其中绿藻包括小球藻；硅藻包括三角褐指藻、纤细角毛藻、小新月菱 形藻和中肋骨条藻；蓝藻包括拟柱胞藻和铜绿微囊藻。
[0013] 进一步地，海洋盐单胞菌的分泌物对赤潮甲藻的最小抑制浓度MIC为 I. 4-3. 5mg/100mL，并且随着分泌物浓度的增加，对赤潮甲藻的抑制效果越明显。
[0014] 与现有技术相比，本发明的细菌的分泌物，可以对海洋中常见的赤潮甲藻塔玛亚 历山大藻，东海原甲藻，米氏凯伦藻有明显的杀伤作用，而对海洋中的一些无毒硅藻，绿藻 并没有抑制作用。因此可以在一些地区选择性的杀死有毒的赤潮甲藻，而对一些有益藻种 生长也具有积极的影响。而且细菌的培养条件简单，产物无需进行提纯，只需过滤去菌体即 可，代谢物的作用时间快速，瞬间抑制效果好，这种"以菌抑藻"方法对以后在赤潮藻预防治 理中有明显应用前景。
【附图说明】
[0015] 图1是一种海洋盐单胞菌的分泌物的提取方法流程图。
[0016] 图2是海洋盐单胞菌的单菌落图。
[0017] 图3是不同浓度的海洋盐单胞菌的分泌物的粗体物对是绿藻、硅藻和蓝藻抑制的 情况。
[0018] 图4是不同浓度的海洋盐单胞菌的分泌物的粗体物对赤潮甲藻塔玛亚历山大藻、 东海原甲藻和米氏凯伦藻抑制的情况。
[0019] 图5是进一步的研宄海洋盐单胞菌的分泌物对塔玛亚历山大藻生长的影响。
[0020] 图6是进一步的研宄海洋盐单胞菌的分泌物对东海原甲藻生长的影响。
[0021] 图7是进一步的研宄海洋盐单胞菌的分泌物对米氏凯伦藻生长的影响。
[0022] 图8是东海原甲藻放大40倍的图，其中图a为正常的东海原甲藻细胞，图b-e是 代表加了海洋盐单胞菌的分泌液后细胞所呈现的畸变形态。
[0023] 图9是塔玛亚历山大藻放大40倍的图，其中图f为正常的塔玛亚历山大藻，图g-j 是代表加了海洋盐单胞菌的分泌液后细胞所呈现的畸变形态。
[0024] 图10是米氏凯伦藻放大40倍的图，其中图k为正常的米氏凯伦藻，图1-0是代表 加了海洋盐单胞菌的分泌液后细胞所呈现的畸变形态。
[0025] 图11是海洋盐单胞菌对3种赤潮甲藻短期抑制的效果流程图。
【具体实施方式】
[0026] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一 步地详细描述。
[0027] 实施例1
[0028] 本实施例中提取海洋盐单胞菌的分泌物的具体流程如图1所示。
[0029] 步骤一，将培养基按照以下比例配制好：酵母粉5g、胰蛋白胨IOg和海水IL ;
[0030] 步骤二，将配置好的培养基在121°C灭菌15min ;
[0031] 步骤三，将如图2所示海洋盐单胞菌在无菌条件下接种到培养基中，于30°C恒温 120转/min摇床上培养10天，细菌可充分的分泌代谢物；
[0032] 步骤四，用0. 45 μ m的膜过滤、除菌得到细菌分泌液上清，OD267为1. 4 ;
[0033] 步骤五，将得到的滤液真空冷冻干燥，再用纯的乙酸提取、滤纸过滤脱盐；
[0034] 步骤六，将得到的滤液挥干乙酸后得到海洋盐单胞菌的分泌物的粗体物，用超纯 水溶解得到粗提液，OD 267为1. 4,浓度7. Omg/mL。
[0035] 海洋盐单胞菌从中国东海分离筛选出。
[0036] 实施例2
[0037] 本实施例中提取海洋盐单胞菌的分泌物的具体流程如图1所示。
[0038] 步骤一，将培养基按照以下比例配制好：酵母粉5g、胰蛋白胨IOg和海水IL ;
[0039] 步骤二，将配置好的培养基在121°C灭菌20min ;
[0040] 步骤三，将如图2所示海洋盐单胞菌在无菌条件下接种到培养基中，于25°C恒温， 150转/min摇床上培养15天，细菌可充分的分泌代谢物；
[0041 ] 步骤四，用0. 22 μ m的膜过滤、除菌得到细菌