一种银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及木本植物银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方 法。
【背景技术】
[0002] 银杏（GinkgobilobaL.)为银杏科银杏属落叶乔木，素有植物界的"活化石"之 称，是现有种子植物中最古老的裸子植物。中国是银杏的故乡，现有的银杏资源约占世界银 杏资源的70%以上。银杏是一种集食用、药用、保健、化妆、用材于一体的优良经济树种 [1]， 近年来，银杏作为全国各地的重要绿化树种也得到了广泛的运用。由于银杏是珍贵孑遗植 物，因此具有许多原始特性，是科学家们重点研宄的植物品种之一，受到不同科研工作者的 重视和研宄。
[0003] 在过去几年里，亚细胞蛋白质组学从一定程度上为蛋白质的定位和功能研宄提供 了新的见解，叶绿体作为绿色植物中重要的细胞器之一具有复杂的结构，是植物通过光合 作用还原和同化二氧化碳、形成碳水化合物的场所，同时也是植物次生物质代谢的场所，研 宄表明树木光合作用的下降与其叶绿体蛋白结构组分的变化有关 [2]，因此叶绿体蛋白质组 的研宄受到越来越多人的关注。
[0004] 双向电泳（tow-dimensionalelectrophoresis, 2-DE)技术是将蛋白质等电点和 分子质量两种特性结合起来进行蛋白质分离的技术，具有较高的分辨率和灵敏度。2-DE技 术是研宄蛋白质组的核心方法之一，已经成为复杂体系中检测和分析蛋白质的一种强有 力的生化手段。近年来，2-DE技术在植物研宄中的应用越来越多，而样品制备是进行2-DE 的先决条件。在样品制备中，增加处理步骤能改善电泳分析结果，但同时也能导致一些蛋 白质的丢失。目前，针对植物组织蛋白质的提取方法较多，但由于不同植物组织和器官所含 有的组成成分不同，从而导致提取方法有所不同，而且由于实验目的的不同，提取方法也会 有所不同。因此，针对不同样品不同组织或器官建立一套可靠而有效的蛋白质提取方法是 2-DE分析成功的关键。
[0005] 由于银杏叶片中蛋白质的含量较低，且富含多酚、色素、多糖及碳水化合物等干 扰物质会影响蛋白质的提取的质量 [3]。多酚类化合物通过氢键可与蛋白质结合，导致电 荷的异质性和蛋白质点的拖尾；色素也能造成蛋白质点拖尾和电荷的异质性；碳水化合物 则阻塞凝胶孔使部分蛋白质沉淀，不仅延长等电聚焦时间，而且使可溶性蛋白质的数量减 少，凝胶图谱上出现横纵条纹 [4]。由此可见，银杏叶片叶绿体蛋白质样品的制备更加困 难。TCA-丙酮沉淀法作为目前蛋白质提取最通用的方法，虽然操作步骤较为简单，蛋白粗 提物的产量较高 [5]，但是在银杏叶绿体蛋白质提取时采用此法所得蛋白粉末的再溶解性较 差，样品中杂质残留较多，2-DE图谱背景模糊并会有明显的条纹[6]。而当前对植物叶绿体 蛋白质提取方法的研宄主要集中在水稻、拟南芥等草本植物 [7]，而银杏作为珍贵孑遗木本 植物，其叶绿体蛋白质提取的效率和质量还不足以满足其蛋白质组学的研宄需要。
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【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种银杏叶绿体蛋白质提取方法，该方法是采用银杏叶片， 先制得叶绿体粗颗粒，再通过Percoll细胞分离液进行梯度离心，用特定的离心力，获得完 整叶绿体。然后采用蛋白质提取缓冲液溶解蛋白质，再加入等体积的Tris-平衡酚抽提后 乙酸铵甲醇溶液沉淀蛋白质。本发明可以有效的增加叶绿体蛋白质提取的效率和纯度。采 用本方法获得的银杏叶绿体蛋白质可用于银杏叶片及其他富含干扰物质的木本植物材料 的蛋白质组学分析时使用，提高了蛋白质的溶解性及纯度，2-DE图谱背景清晰，可分辨的蛋 白质点数多。
[0014] 与已公开发表的银杏叶绿体提取方法相比，本方法所需的实验条件更易满足，不 需要使用超高速冷冻离心机提前混合Percoll且只需两个Percoll梯度即能完成完整叶绿 体的提取。与传统TCA-丙酮沉淀法提取叶绿体蛋白质相比，本方法通过对离心时间、离心 速度、沉淀时间等操作步骤改进和蛋白提取缓冲液中增加适量去污剂TritonX-100等的方 式使提取的叶绿体蛋白质所含干扰物质明显减少，纯度更高，双向电泳效果更好，2-DE图谱 背景清晰，条纹影响较小，得到了更多数量的蛋白质点，且蛋白点外观圆滑清晰，聚焦情 况良好。
[0015] 本发明所述银杏叶片叶绿体蛋白质提取方法，包括以下主要步骤：
[0016] (1)采用经24小时以上暗处理后耗尽淀粉粒的银杏叶片10g;
[0017] (2)将叶片冰浴下用研钵碾碎，加入一定量的提取缓冲液研磨成浆后4层纱布过 滤，取滤液，所述提取缓冲液成分为：〇. 3M山梨醇，ImMMgCl2,50mMHEPES/KOH(pH7. 8)，2mM￡0丁六，0.04%巯基乙醇，0.1%?￥卩；
[0018](3)滤液于4°C，1500g离心lOmin进行沉积得叶绿体沉淀颗粒，并用用6ml分离缓 冲液悬浮，所述分离缓冲液成分为：〇. 3M山梨醇，ImMMgCl2,50mMHEPES/KOH(pH7. 8)，2mM EDTA；
[0019] (4)Percoll密度梯度液制备：用分离缓冲液分别配制40%和80%Percoll，由上 至下分别加入5ml的40%Percol和2. 5ml的80%Percoll，形成Percoll密度梯度液；
[0020] (5)将悬浮的叶绿体颗粒1ml加入到制好的Percoll密度梯度液的顶端，经4°C， 6000g离心30min后。在80%和40%Percoll细胞分离液之间的分界面上收集完整叶绿 体，并用分离缓冲液清洗两次，分离得到完整的叶绿体颗粒；
[0021] (6)将1. 5ml蛋白质提取缓冲液加入到由10g银杏叶片所提取的叶绿体颗粒中， 室温下漩涡混匀5min，加入等体积的Tris-平衡酚（pH8. 0)，超声波混匀lOmin。所述蛋 白质提取缓冲液成分为：l〇〇mMTris,lOOmMEDTA, 50mM硼砂，50mM维生素C，1 %Triton 父-100,2%巯基乙醇，30%蔗糖；
[0022] (7)混合液经4°C，15000g离心15min后，将上层的酚相转移到新离心管中；
[0023] (8)酚相中加入5倍体积的0? 1M醋酸銨（用80%甲醇配）溶液，放入-20 °C条件 下6小时以上以沉淀蛋白，后经4°C，15000g离心15min得蛋白质颗粒；
[0024] (9)蛋白质颗粒重新悬浮，用冰冻的甲醇和丙酮各清洗两次，每次清洗均经4°C， 15000g离心5min