相II与步骤（2)中有机相I合并，使用旋转蒸发仪在50°C，减压去除食品级 乙酸乙酯，即得松茸挥发油；
[0042](5)将水相II在60°C，减压状态下浓缩至原体积的1/8 ;
[0043] (6)将步骤（5)的浓缩液加入无水乙醇，使乙醇浓度体积分数95%，充分搅拌，静 置过夜，过滤，收集沉淀，保留乙醇母液；
[0044](7)将步骤（6)的沉淀用无水乙醇洗涤后，经蒸馏水溶解，过滤，滤液经过大孔吸 附树脂AB-8分离，控制吸附流速2BV/h，用水洗脱，洗脱流速lBV/h，收集洗脱液，浓缩，干 燥，即得松茸多糖；
[0045] (8)将步骤（6)的乙醇母液浓缩，经蒸馏水分散后，用活性炭脱色、过滤，滤液经截 留分子量为l〇〇〇Da的超滤膜分离，所得的过滤液置于D001大孔型强酸型苯乙烯系阳离子 交换树脂进行交换，用〇. 5mol/L的氨水进行洗脱，收集洗脱液至茚三酮检测无色为止，洗 脱液减压蒸馏浓缩，干燥，得从松茸中提取的氨基酸。
[0046] 实施例3
[0047] 一种从松茸中同时提取挥发油、多糖和氨基酸的方法，由以下步骤组成：
[0048] (1)取1重量份过200目筛的松茸粉末，加入10重量份的蒸馏水，再加入0? 01重 量份的几丁质酶：木瓜蛋白酶：中性蛋白酶=1. 5:2:1的混合酶溶解，连续搅拌，50°C酶解 3h；
[0049] (2)将步骤（1)样品采用水蒸气蒸馏法在沸腾条件下提取16h，蒸馏出含挥发油的 液体并用食品级乙酸乙酯萃取，再分液分离得到含挥发油的有机相I ;
[0050] (3)将步骤（2)提取挥发油后的料液过滤，得到滤液和滤渣，再往滤渣中加入10重 量份的蒸馏水，在真空度_〇. 〇6MPa和温度50°C的条件下浸提，过滤，重复本步骤3次，合并 所有滤液；
[0051] (4)将步骤（3)中的滤液用食品级乙酸乙酯萃取、再用分液漏斗分离得有机相II 和水相II，有机相II与步骤（2)中有机相I合并，使用旋转蒸发仪在40°C，减压去食品级乙 酸乙酯，即得松茸挥发油；
[0052](5)将水相II在40°C，减压状态下浓缩至原体积的1/4 ;
[0053] (6)将步骤（5)的浓缩液加入无水乙醇，使乙醇浓度体积分数80%，充分搅拌，静 置过夜，过滤，收集沉淀，保留乙醇母液；
[0054] (7)将步骤（6)的沉淀用无水乙醇洗涤后，经蒸馏水溶解，过滤，滤液经过大孔吸 附树脂AB-8分离，控制吸附流速2BV/h，用水洗脱，洗脱流速lBV/h，收集洗脱液，浓缩，干 燥，即得松茸多糖；
[0055] (8)将步骤（6)的乙醇母液浓缩，经蒸馏水分散后，用活性炭脱色、过滤，滤液经截 留分子量为l〇〇〇Da的超滤膜分离，所得的过滤液置于D001大孔型强酸型苯乙烯系阳离子 交换树脂进行交换，用〇. 5mol/L的氨水进行洗脱，收集洗脱液至茚三酮检测无色为止，洗 脱液减压蒸馏浓缩，干燥，得从松茸中提取的氨基酸。
[0056] 实施例4
[0057] -种从松茸中同时提取挥发油、多糖和氨基酸的方法，由以下步骤组成：
[0058] (1)取1重量份过100目筛的松茸粉末，加入30重量份的蒸馏水，再加入0. 005重 量份的几丁质酶：木瓜蛋白酶：中性蛋白酶=1. 5:2:1的混合酶溶解，连续搅拌，55°C酶解 4h；
[0059] (2)将步骤（1)样品采用水蒸气蒸馏法在沸腾条件下提取12h，蒸馏出含挥发油的 液体并用食品级乙酸乙酯萃取，再分液分离得到含挥发油的有机相I ;
[0060] (3)将步骤（2)提取挥发油后的料液过滤，得到滤液和滤渣，再往滤渣中加入5重 量份的蒸馏水，在真空度_〇. 〇5MPa和温度50°C的条件下浸提，过滤，重复本步骤4次，合并 所有滤液；
[0061] (4)将步骤（3)中的滤液用食品级乙酸乙酯萃取、再用分液漏斗分离得有机相II 和水相II，有机相II与步骤（2)中有机相I合并，使用旋转蒸发仪在50°C，减压去除食品级 乙酸乙酯，即得松茸挥发油；
[0062](5)将水相II在50°C，减压状态下浓缩至原体积的1/6 ;
[0063](6)将步骤（5)的浓缩液加入无水乙醇，使乙醇浓度体积分数85%，充分搅拌，静 置过夜，过滤，收集沉淀，保留乙醇母液；
[0064] (7)将步骤（6)的沉淀用无水乙醇洗涤后，经蒸馏水溶解，过滤，滤液经过大孔吸 附树脂AB-8分离，控制吸附流速2BV/h，用水洗脱，洗脱流速lBV/h，收集洗脱液，浓缩，干 燥，即得松茸多糖；
[0065] (8)将步骤（6)的乙醇母液浓缩，经蒸馏水分散后，用活性炭脱色、过滤，滤液经截 留分子量为l〇〇〇Da的超滤膜分离，所得的过滤液置于D001大孔型强酸型苯乙烯系阳离子 交换树脂进行交换，用〇. 5mol/L的氨水进行洗脱，收集洗脱液至茚三酮检测无色为止，洗 脱液减压蒸馏浓缩，干燥，得从松茸中提取的氨基酸。
[0066] 实施例5
[0067] 取实施例1得到松茸多糖，通过采用CCK-8测定其对宫颈癌Hela细胞、乳腺癌 MCF-7细胞和结直肠癌HCT-116细胞的抑制率，判断松茸多糖的抗肿瘤活性。
[0068] 具体操作步骤：
[0069] 取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2 X 105/mL，取100 y L的细胞悬液接种于96 孔板中，于37°C、5% C02培养箱内培养24h后，向培养板中加入10yL不同浓度的松茸多 糖，继续培养48h，之后向每孔加入10 y L的CCK，并在培养箱中孵育4h，用酶标仪在450nm 处测定其吸光度值，根据公式（1)计算细胞抑制率。实验结果见表1。
[0070]细胞抑制率（％) = l-(Aj-A〇V(Ai_Ao) X100% 公式（1)
[0071] Aj :具有细胞、CCK溶液和松茸多糖的孔的吸光度；
[0072] Ao :具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度；
[0073] Ai :具有细胞、CCK溶液而没有松茸多糖的孔的吸光度。
[0074] 表1不同浓度松茸多糖对HCT-116、MCF_7和Hela细胞的抑制率
[0075]
【主权项】
1. 一种从松茸中同时提取挥发油、多糖和氨基酸的方法，其特征在于，由以下步骤组 成： (1)取1重量份过100?300目筛的松茸粉末，加入10?30重量份的蒸馏水，再加入 0. 005?0. 02重量份的几丁质酶：木瓜蛋白酶：中性蛋白酶=1. 5:2:1的混合酶溶解，连续 搅拌，40?55°C酶解2?4h; (2) 将步骤（1)样品采用水蒸气蒸馏法在沸腾条件下提取8?16h，蒸馏出含挥发油的 液体并用有机溶剂萃取，再分液分离得到含挥发油的有机相I ; (3) 将步骤（2)提取挥发油后的料液过滤，得到滤液和滤渣，再往滤渣中加入5?20重 量份的蒸馏水，在真空度_〇. 02?-0. 08MPa和温度40?60°C的条件下浸提，过滤，重复本 步骤2?4次，合并所有滤液； (4) 将步骤（3)中的滤液用有机溶剂萃取、再用分液漏斗分离得有机相II和水相II，有 机相II与步骤（2)中有机相I合并，使用旋转蒸发仪在40?50°C，减压去除有机溶剂，即得 松茸挥发油； (5) 将水相II在40?60°C，减压状态下浓缩至原体积的1/4?1/8 ; (6) 将步骤（5)的浓缩液加入无水乙醇，使乙醇浓度体积分数为75?95%，充分搅拌， 静置过夜，过滤，收集沉淀，保留乙醇母液； (7) 将步骤（6)的沉淀用无水乙醇洗涤后，经蒸馏水溶解，过滤，滤液经过大孔吸附树 脂分离，用水洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得松茸多糖； (8) 将步骤（6)的乙醇母液浓缩，经蒸馏水分散后，用活性炭脱色、过滤，滤液经截留分 子量为lOOODa的超滤膜分离，所得的过滤液置于阳离子交换树脂进行交换，浓缩，干燥，得 从松茸中提取的氨基酸。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)和（4)中所述有机溶剂为乙酸乙 酯。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为AB-8。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂为D001大孔型强酸 型苯乙烯系阳离子交换树脂。
【专利摘要】本发明公开了一种从松茸中同时提取挥发油、多糖和氨基酸的方法。本方法在提取过程中很好的保留松茸有效成分，且经过多次提取纯化分离得到松茸挥发油、多糖和氨基酸三种物质，提高松茸资源的利用率，拓宽松茸加工方向，促进松茸加工产业的发展。
【IPC分类】C08B37-00, C07B63-00, C12P13-04, C11B9-02
【公开号】CN104593441
【申请号】CN201410855261
【发明人】郭燕飞, 张燕燕, 艾中, 李文佳, 钱正明, 林基杭
【申请人】广东东阳光药业有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月31日