一种向聚酮骨架引入氨基酸来源的侧链的生物合成方法及相关基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及聚酮合成体系中，向聚酮骨架引入氨 基酸来源的侧链的生物合成方法及生物合成相关的基因。
【背景技术】
[0002] 聚酮化合物（polyketides，PKs)是一大类重要的天然产物，广泛来源于细菌、真 菌、植物等。包括大环内酯类、蒽环类、聚醚类、四环素类。聚酮化合物不仅结构多样，而且 具有很好的生物学和药物活性（Angew Chem Int Ed Engl, 2009，48(26): 4688-4716.)。 如抗细菌药(如四环素，利福霉素)、抗真菌药(如灰黄霉素、两性霉素)、抗寄生虫药(如阿维 霉素、奈马克丁)、抗癌药(如多柔比星、烯二炔)、抗胆固醇药(如洛伐他汀）等聚酮来源的药 物几乎已用于所有重要疾病的治疗（Nat Prod R印，2001，18(4): 380-416.)。
[0003] 天然聚酮化合物尽管种类繁多，其生物合成机制却相对保守，从本质而言，被酰 基辅酶A (acyl-CoA)活化的前体物(包括起始单元和延伸单元）在聚酮合酶（PKS)的催 化下进行反复的脱羧一缩合反应形成一定长度的聚酮碳骨架，然后再经过环化或芳香化， 甲基化，糖基化，氧化还原，脱水等修饰过程，形成各种各样结构复杂的聚酮类化合物。根 据聚酮合酶的结构及其它性质，聚酮合酶被分成I -III型PKS( Curr Opin Chem Biol, 2003，7(2): 285-295.)，其中I型PKS，可分为模块化PKS和重复型PKS，模块化即以模块 的形式形成多功能酶，其中一整套合成聚酮化合物碳骨架的必需的结构域（domain)聚合 在一起组成一个模块(module),每个结构域只参与整个聚酮碳链构建中的一步生化反应 (non-interative)。重复型I型PKS和模块化I型PKS核心结构域类似，不同之处在于重 复型PKS可以重复利用某个结构域来合成目的产物。合成聚酮碳链的核心结构域包括酰 基转移酶（acyltransferase，AT)、醜基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP)和 酮 酰基合成酶（ketosynthase，KS)组成，首先由作为"门卫"（gate keeper)的AT结构域 识别并选择性地将起始单元和延伸单元上载到ACP的来自于辅酶A (CoA)的磷酸泛酰乙 胺巯基臂上，再由KS将不同的单元经过一系列脱羧缩合反应（claisen condesation)组 装成碳骨架。I型PKS主要合成大环内酯，聚醚，聚烯类化合物。II型PKS，也称迭代型 (iterative)或芳香型PKS，其主要合成蒽环类，四环素类等芳香族化合物。II型PKS通过 重复使用一套结构域，多次催化相同延伸单元的脱羧缩合使聚酮碳骨架得到延伸，形成了 链状的中间体，随后通过环化酶和芳构化酶催化使之形成芳香环。III型PKS，属于查尔酮合 成酶（chalconesynthase，CHS)类，主要负责单环或双环芳香类聚酮化合物的生物合成。
[0004] 聚酮衍生的药物每年涉及的销售额达到了数千亿美元，对聚酮天然产物的开 发是当前新药研发领域的一个重要方向，所以获得多样化聚酮结构类似物是新药研发的 首要条件。决定聚酮天然产物多样性的环节基本相同，主要为：1)起始单元，2)延伸 单元和修饰方式，3)骨架解离及4)后修饰（Drug Discov Today, 2009，14(21-22): 1011-1020.)。其中，起始单元和延伸单元作为合成砌块构成了聚酮碳骨架的主链和侧链； 解离方式决定了碳骨架的环合或线性化；延伸单元的修饰以及后修饰通常是对碳骨架上的 一些羟基、羰基等活泼基团的修饰。对于后修饰产生的结构变化，通常可以由化学方法较好 的互补，但对于由起始单元和延伸单元缩合生成的碳骨架，选择性化学改造基本无法实现。 不过，通过合成生物学手段，将PKS中负责缩合单元上载的AT模块替换成识别不同单元的 AT，或通过定点突变的方法改变AT结构域的选择性，再配以新缩合单元的生物合成途径， 可以实现在聚酮的碳骨架上选择性的引入不同的侧链，获得一系列聚酮类似物。这种AT模 块替换（AT swapping)方法已经成为目前创造碳骨架多样性的最为有效的手段（Nat Rev Micro, 2005. 3(12): 925-36; Curr Opin Microbiol, 2007. 10(3): 238-45; Curr. Opin. Struct. Biol. 2013，23，603-612)。尽管理论上通过这种方法，可以任意修改聚 酮碳骨架，但事实上，通过改变延伸单元得到的衍生物却很少。其主要原因在于1)天然的 延伸单元结构类型单一；2)聚酮催化模块，特别是识别延伸单元的酰基转移蛋白-AT的底 物选择性较高。
[0005]自然界中存在两类聚酮延伸单元，辅酶A(CoA)承载和ACP承载的延伸单元（图1)。 CoA承载的延伸单元应用最为普遍，一般通过酰基辅酶的a羧化（Nat. Prod. R印.2009， 26，90-114)、丙二酸与 CoA连接（Eur. J. Biochem. 1998，257，395-402)、a不饱和 脂肪酸-CoA 的还原羧化（Nat. Prod. R印? 2012，29，72-86; J. Am. Chem. Soc. 2009， 131, 10376-10377 ；J. Am. Chem. Soc. 2010, 133, 976-985 ；J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 1971-1977 ;Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 4667-4670)而合成。ACP 承载的延 伸单元，应用范围较窄，只存在于极少数的PKS体系（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006， 103, 14349-14354 ；Chem. Biol. 2006, 13, 575-585 ；J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 18032-18035)。CoA承载的延伸单元主要来源于脂肪酸代谢，因此，他们的C-a侧链大多属 于简单脂肪族化合物。相应地，AT结构域的特异性与延伸单元严格一致，仅限于简单的化学 结构。由于有限的延伸单元和AT结构域的选择特异性，目前，能够引入延伸单元的化学空 间范围多限于简单的脂肪族化合物。尽管延伸单元的体外合成（J. Am. Chem. Soc. 2001， 123，5822-5823)和用酰基-NAC硫酯作为延伸单元替代品（Nat. Prod. R印.2008，25， 25-34)可以稍微减轻这种困境，但是高昂的制备成本和极低的掺入效率仍然限制了它们的 应用。
[0006] 和脂肪酸一样，氨基酸常被广泛用作聚肽和生物碱的生物合成装配单元，是另一 大类生物大分子合成的碳源。然而，在聚酮的生物合成过程中，却只有丝氨酸和脯氨酸被 用于合成氨基丙二酰单酰辅酶A (aminomalonyl-ACP)(图1 (1))和二氯批咯丙基丙二 醜单醜 _ACP (dichloropyrrolypropylmalonyl-ACP)(图 1 (2))参与 了两个 PKS 合成体 系（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006，103，14349-14354 ;J. Am. Chem. Soc. 2013， 135，18032-18035.)。和脂肪酸不一样的是，氨基酸含有丰富的功能基团，像氨基和硫 醇，能进一步作为化学半合成的靶点。此外，通过现有的生物合成机制，如苯丙氨酸羟化酶 (Nature 2010，468，461-464)和色氨酸卤化酶（Mol. BioSyst. 2011，7，852-861)进 一步增加氨基酸芳香基团的多样性，从而增加药物分子的亲脂性和与靶蛋白之间的 堆积力，提高药物分子的生物利用度和生物活性（Expert Opin. Drug Discov. 2014，9， 995-1003)。将氨基酸转化为延伸单元，可以在极大程度上拓展聚酮的化学和结构多样性。 但是，目前，氨基酸来源的聚酮延伸单元极少，只有上述丝氨酸和脯氨酸来源的两种，由于 两者都为ACP承载的延伸单元，不能广泛应用于聚酮合成体系，此外，其生物合成途径较为 复杂，难以用于改造聚酮骨架，且不能普遍适用于将其他氨基酸引入聚酮骨架，所以找到一 个将氨基酸转化为聚酮延伸单元的通用方法是目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007] 针对上述情况，本发明的目的是提供一种向聚酮骨架中引入氨基酸来源侧链的生 物合成方法，其包括如下步骤： 1、 将氨基酸经氨基酸裂解酶催化形成a，不饱和的羧酸； 2、 辅酶A连接酶催化a，不饱和的羧酸，形成a，不饱和的羧酸辅酶A ; 3、 由巴豆酰辅酶A还原羧化酶催化a，不饱和的羧酸辅酶A形成取代的丙二酰单 酰辅酶A ; 4、 聚酮合成酶中的AT模块选择并上载取代的丙二酰单酰辅酶A进入聚酮合成过程，实 现将氨基酸来源的侧链引入至聚酮化合物的碳骨架中。
[0008] 进一步的，本发明提供一种向聚酮骨架中引入苯丙氨酸来源侧链芳香型苄基的生 物合成方法，其包括如下步骤： 1、 苯丙氨酸裂解酶EnCcP催化苯丙氨酸发生还原脱氨生成肉桂酸； 2、 肉桂酸辅酶A连接酶EnqH的催化下生成肉桂酸辅酶A ; 3、 巴豆酰辅酶A还原羧化酶SpnE催化发生还原羧化反应生成苄基丙二酰单酰辅酶A ; 4、 聚酮合成酶SpnD中的特殊AT结构域识别苄基丙二酰单酰辅酶A并上载至聚酮骨 架。
[0009] 所述途径中相关基因来源于海洋链霉菌Streptomyces sp. CNQ431中的 splenocin(SPNs)和 enterocin (ENC)生物合成基因族，包括基因 八
[0010] 抗霉素（antimycin ANTs)是一类具有优异的抑制由过敏原引起的过敏性哮喘活