一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法。
【背景技术】
[0002]发菜(Ab1S1c flagelliforme),又称发状念珠藻,属蓝菌门念珠藻目，发菜主要产于中国西北部的干旱和半干旱地区，发菜是一种能固氮的光合原核生物，它的丝状体中主要有两种细胞:一种是营养细胞，呈绿色，进行光合作用，吸收、释放、合成有机物质；另一种是异形细胞，体积较大，细胞壁较厚，颜色较淡，主要进行固氮作用，把空气中的氮气还原成氨，合成氨基酸。
[0003]发菜的营养价值很高，尤其是蛋白质的含量较高，每千克发菜中含蛋白质200?234.1克，还含有海胆酮、蓝藻叶黄素、藻蓝素和别藻蓝素等，营养成分高于同量的肉类与蛋类；发菜有较高的药用价值，其性平，味甘淡，有平肝潜阳、清肠止痢的功效；可清热解毒、化痰止咳、凉血明目、通便利尿,对佝偻病、痢疾、高血压、气管炎、鼻出血、营养不良等多种疾病都有一定疗效，并且发菜中具有高氨基酸评分的氨基酸组成，因此测定发菜中蛋白质的氨基酸的含量，对于评价发菜的营养与药用价值有重要意义。
[0004]氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，与生物的生命活动有着密切的关系，是生物体内不可缺少的营养成分之一；研究一种操作简单、提取率高的从发菜中提取氨基酸的方法很有必要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种操作简单、提取率高的从发菜中提取氨基酸的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:
一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，包括以下步骤:
步骤一:无菌条件下将发菜细胞接种到BG-1I液体培养基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期进行25°C恒温培养，光照强度为1800~2200LuX，恒温培养15~20天后，得发菜细胞培养液备用；
步骤二:将步骤一所得发菜细胞培养液抽滤后，取滤渣用水洗去黏状物质，去除发菜中的胶质，得发菜细胞，备用；
步骤三:将步骤二所得的发菜细胞于40~60°C条件下干燥至恒重，研磨粉碎，过40目筛网，得发菜细胞粉末备用；
步骤四:将步骤三所得的发菜细胞粉末按照1:20~1:50的料液比加入体积分数为30%~75%的乙醇水溶液，于水浴温度为50~80°C条件下超声提取30~75min，过滤，得发菜细胞提取液；
步骤五:将步骤四所得的发菜细胞提取液于3500~4500rpm条件下离心分离15~25min,取上清液，即得发菜氨基酸提取液；
所述步骤一中光照强度为2000LUX ； 所述步骤三中将所得的发菜细胞于50°C条件下干燥至恒重；
所述步骤四中将所得的发菜细胞粉末按照1:40的料液比加入体积分数为60%的乙醇，于水浴温度为70°C条件下超声提取60min，过滤，得发菜细胞提取液；
所述步骤五中将所得的发菜细胞提取液于4000rpm条件下离心分离20min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
[0007]本发明的有益效果:
本发明提供的悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，采用悬浮培养发菜细胞，利用超声波提取发菜中的氨基酸，不仅能有效破碎细胞，而且还具有操作简单、提取时间短、消耗溶剂低、得率高、无需加热等优点，提取率可达到7.2%，为研究开发具有高氨基酸评价分的产品做出了贡献。
【具体实施方式】
[0008]下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步的阐述。
[0009]实施例1
一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，包括以下步骤:
步骤一:无菌条件下将发菜细胞接种到BG-1I液体培养基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期进行25°C恒温培养，光照强度为2000LUX，恒温培养18天，得发菜细胞培养液备用;
步骤二:将步骤一所得发菜细胞培养液抽滤后，取滤渣用水洗去黏状物质，去除发菜中的胶质，得发菜细胞，备用；
步骤三:将步骤二所得的发菜细胞于50°C条件下干燥至恒重，研磨粉碎，过40目筛网，得发菜细胞粉末备用；
步骤四:将步骤三所得的发菜细胞粉末按照1:40的料液比加入体积分数为60%的乙醇水溶液，于水浴温度为70°C条件下超声提取60min，过滤，得发菜细胞提取液；
步骤五:将步骤四所得的发菜细胞提取液于4000rpm条件下离心分离20min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
[0010]实施例2
一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，包括以下步骤:
步骤一:无菌条件下将发菜细胞接种到BG-1I液体培养基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期进行25°C恒温培养，光照强度为ISOOLux，恒温培养20天，得发菜细胞培养液备用;
步骤二:将步骤一所得发菜细胞培养液抽滤后，取滤渣用水洗去黏状物质，去除发菜中的胶质，得发菜细胞，备用；
步骤三:将步骤二所得的发菜细胞于40°C条件下干燥至恒重，研磨粉碎，过40目筛网，得发菜细胞粉末备用；
步骤四:将步骤三所得的发菜细胞粉末按照1:20的料液比加入体积分数为75%的乙醇，于水浴温度为50°C条件下超声提取30min，过滤，得发菜细胞提取液；
步骤五:将步骤四所得的发菜细胞提取液于3500rpm条件下离心分离25min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
[0011]实施例3
一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，包括以下步骤:
步骤一:无菌条件下将发菜细胞接种到BG-1I液体培养基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期进行25°C恒温培养，光照强度为2200LUX，恒温培养15天，得发菜细胞培养液备用;
步骤二:将步骤一所得发菜细胞培养液抽滤后，取滤渣用水洗去黏状物质，去除发菜中的胶质，得发菜细胞，备用；
步骤三:将步骤二所得的发菜细胞于60°C条件下干燥至恒重，研磨粉碎，过40目筛网，得发菜细胞粉末备用；
步骤四:将步骤三所得的发菜细胞粉末按照1:50的料液比加入体积分数为30%的乙醇，于水浴温度为80°C条件下超声提取75min，过滤，得发菜细胞提取液；
步骤五:将步骤四所得的发菜细胞提取液于4500rpm条件下离心分离15min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
[0012]BG-1l 培养基=NaNO3 1.5g, K2HPO4.3H20 0.04g, MgSO4.7H20 0.075g, CaCl2.2H200.036g 柠檬酸 0.006g，柠檬酸铁铵 0.006g, EDTA 0.0Olg, Na2CO3 0.02g, A5 溶液 1000 XImL,蒸懼水 919mL。
[0013]氨基酸含量的测定
(1)标准溶液的制备
配制0.1 mg / mL的标准L-谷氨酸溶液；
(2)测定波长的选择
准确称取发菜粉末0.20g于具塞试管中，加入60%乙醇8mL，于70°C、功率70%条件下超声提取60 min后，于4000rpm条件下离心分离20min，取上清液定容至10mL，再取I mL样品溶液稀释至10mL，即为待测的氨基酸提取液；
分别取标准液和待测样品液各2mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液ImL和茚三酮显色液2mL,混勻后于100°C沸水浴中加热15min后冷却,放置5min后,加311^60%乙醇稀释,摇匀后在紫外-可见分光光度计中进行波长扫描，每种液体平行做3次，取平均值，结果显示对照品溶液和样品溶液在570nm处均有最大吸收,最后选择570 nm为本试验的最佳测定波长;
(3)标准曲线的制备
分别取20ug/mL的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL于试管中，用水补足至2mL。各加入ImL pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入2mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100°C水浴中加热15min后冷却，放置5min后，加入3mL 60%乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定A957tol。(脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定fl944tol)。以X表示谷氨酸体积分数，Y表示相应体积分数的吸光度值，得出标准方程为Y=0.0377X+0.0054 (R2=0.9999)；
(4)氨基酸含量的测定
将待测的氨基酸提取液加入ImL pH5.4,2mol/L醋酸缓冲液；再加入2mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100°C水浴中加热15min后冷却，放置5min后，加入3mL60%乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定A^57tol，将得到的吸光值代入回归方程，测得氨基酸的含量为7.2%。
【主权项】
1.一种悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一:无菌条件下将发菜细胞接种到BG-1I液体培养基中，然后按照12h光照12h黑暗的光照周期进行25°C恒温培养，光照强度为1800~2200LuX，恒温培养15~20天后，得发菜细胞培养液备用； 步骤二:将步骤一所得发菜细胞培养液抽滤后，取滤渣用水洗去黏状物质，去除发菜中的胶质，得发菜细胞，备用； 步骤三:将步骤二所得的发菜细胞于40~60°C条件下干燥至恒重，研磨粉碎，过40目筛网，得发菜细胞粉末备用； 步骤四:将步骤三所得的发菜细胞粉末按照1:20~1:50的料液比加入体积分数为30%~75%的乙醇水溶液，于水浴温度为50~80°C条件下超声提取30~75min，过滤，得发菜细胞提取液； 步骤五:将步骤四所得的发菜细胞提取液于3500~4500rpm条件下离心分离15~25min,取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
2.如权利要求1所述的悬浮培养发菜氨基酸提取方法，其特征在于:所述步骤一中光照强度为2000LUX。
3.如权利要求1所述的悬浮培养发菜氨基酸提取方法，其特征在于:所述步骤三中将所得的发菜细胞于50°C条件下干燥至恒重。
4.如权利要求1所述的悬浮培养发菜氨基酸提取方法，其特征在于:所述步骤四中将所得的发菜细胞粉末按照1:40的料液比加入体积分数为60%的乙醇，于水浴温度为70°C条件下超声提取60min，过滤，得发菜细胞提取液。
5.如权利要求1所述的悬浮培养发菜氨基酸提取方法，其特征在于:所述步骤五中将所得的发菜细胞提取液于4000rpm条件下离心分离20min，取上清液，即得发菜氨基酸提取液。
【专利摘要】本发明提供的悬浮培养发菜氨基酸的提取方法，采用悬浮培养发菜细胞，利用超声波提取发菜中的氨基酸，不仅能有效破碎细胞，而且还具有操作简单、提取时间短、消耗溶剂低、得率高、无需加热等优点，提取率可达到7.2%，为研究开发具有高氨基酸评价分的产品做出了贡献。
【IPC分类】C12R1-01, C12P13-00
【公开号】CN104593438
【申请号】CN201510024997
【发明人】郭金英, 胡娟娟
【申请人】河南科技大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月19日