发菜多糖作为制备免疫调节药物或保健品的用途
【专利摘要】本发明涉及一种发菜多糖作为制备免疫调节药物或保健品的用途，发现野生发菜多糖以及人工培养发菜多糖具有显著的免疫调节功能，灌胃老鼠14天后，对老鼠体重无明显影响，两种多糖可以在一定程度上增强小鼠的碳廓清能力、促进小鼠的迟发性超敏反应、促进ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力、提高NK细胞的杀伤活性。本发明提示两种发菜多糖可明显提高机体NK细胞活性、巨噬细胞吞噬能力、提高机体细胞免疫及体液免疫功能，因此对机体具有免疫调节作用。
【专利说明】发菜多糖作为制备免疫调节药物或保健品的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于发菜领域，涉及一种发菜多糖新用途，尤其是一种发菜多糖作为制备免疫调节药物或保健品的用途。
【背景技术】
[0002]发菜(发状念珠藻，Nostoc flagelliforme)为一种陆生蓝藻，属原核生物界,蓝藻门蓝藻纲，念珠藻目念珠藻科，念珠藻属。在我国主要分布于北部和西北部的干旱、半干旱地区，如宁夏、甘肃和内蒙古地区。发菜对恶劣环境具有极强的适应性，其生长过程中向细胞外分泌大量的胶状物质，包裹于发菜细胞及藻丝外，形成胶质鞘，保护发菜细胞不受干旱、高温、紫外辐射的损伤，胶状物质的主要成分为多糖。发菜对于维护生态环境，防止干旱地区沙漠化具有重要作用。
[0003]野生发菜生长极其缓慢，年生长率不足10%。为了保护珍贵的野生资源，有大量研究人工培养发菜及其细胞的报道，其中利用液体培养发菜细胞可获得比野生条件下高数百倍的生物量，同时从培养液还可获得胞外多糖。通过比较发现，从人工发菜细胞培养液和从野生发菜提取的发菜多糖具有相近的组成和性质，通过对其单糖组成研究发现两种发菜多糖均主要由葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸等组成，是一种非硫酸化多糖。
[0004]近年来发现发菜具有重要的药用价值，发菜多糖对流感病毒，人巨细胞病毒，单疱疹病毒等具有很强的抗病毒活性，同时还发现具有抗肿瘤活性等多种功效。然而，很少有研究针对发菜多糖的免疫调节活性报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种发菜多糖作为制备免疫调节药物或保健品的用途，涉及发菜多糖调节机体免疫功能，通过对野生和人工培养发菜多糖免疫调节作用进行研究，表明两种发菜多糖均能提高单核-巨噬细胞吞噬功能，以及提高NK细胞的杀伤活性，促进由ConA和LPS诱导的淋巴细胞增殖能力。
[0006]本发明实现目的的技术方案如下:
[0007]一种发菜多糖作为制备免疫调节药物的用途。
[0008]而且，所述发菜多糖为从野生状态下发菜藻丝中提取的野生发菜多糖。
[0009]而且，所述发菜多糖来源于发菜细胞人工液体培养液的人工培养发菜多糖。
[0010]一种发菜多糖作为制备免疫调节保健品的用途。
[0011]而且，所述发菜多糖为从野生状态下发菜藻丝中提取的野生发菜多糖。
[0012]而且，所述发菜多糖来源于发菜细胞人工液体培养液的人工培养发菜多糖。
[0013]本发明的优点和积极效果如下:
[0014]本发明通过热水浸提、超滤浓缩、醇沉方法从野生发菜中获得野生发菜粗多糖，另外，还通过人工液体培养发菜细胞，对其过滤除去发菜细胞的培养液采取超滤浓缩、醇沉方法获得人工培养发菜多糖，再用雄性BALB/C小鼠，测定了二者免疫调节活性，可以在一定程度上增强小鼠的碳廓清能力、促进小鼠的迟发性超敏反应、促进ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力、提高NK细胞的杀伤活性，因此，两种发菜多糖对机体具有免疫调节作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为苯酚-硫酸法标准曲线；
[0016]图2为野生发菜多糖体内对正常小鼠脾NK细胞活性的影响(n=6)；
[0017]图3为野生发菜多糖对脾细胞增殖的影响(n=6)；
[0018]图4人工培养发菜多糖体内对正常小鼠脾NK细胞活性的影响(n=6)；
[0019]图5人工培养发菜多糖对脾细胞增殖的影响(n=6)；
【具体实施方式】
[0020]下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0021]实施例1
[0022]1.野生发菜多糖的提取及免疫调节功能检测:
[0023]1.1野生发菜多糖的提取方法:
[0024]野生发菜洗净后热水浸提70min，连续浸提4次。将浸提液混合后用截流分子量为10000的中空纤维膜浓缩。浓缩 液用80%的乙醇溶液醇沉，冻干后待用。
[0025]1.2多糖含量测定
[0026]本实验采用苯酚-硫酸法测定野生发菜粗多糖中的多糖含量。苯酚-硫酸法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定。该方法简单，灵敏度高，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。实验时基本不受蛋白质存在的影响。实验步骤如下:
[0027](I)、制作标准曲线:分别准确移取 0.1mL,0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、
0.7mL、0.8mL、0.9mL、l.0mL的150mg/L标准葡萄糖溶液放入试管中，加蒸馏水至每管总体积为2.0mL,以2.0mL蒸馏水作为空白对照。
[0028]向每支试管中加入6%的苯酹溶液1.0mL,混匀后加入5mL浓硫酸,沸水浴加热lOmin，冷却至室温后，490nm下测其吸光度，绘制标准曲线(多糖标准曲线见附图1)。
[0029](2)、多糖含量的测定及计算:分别准确称取0.0200g野生发菜多糖，各自配成IOOml溶液，然后分别准确量取LOmL自养和野生发菜多糖溶液，加入蒸馏水1.0mL，以2.0mL蒸懼水作为空白对照，向每支试管中加入6%的苯酹溶液1.0mL,混匀后加入浓硫酸5mL，沸水浴加热lOmin，冷却至室温后，490nm下测其吸光度。
[0030]在490nm下，测得野生发菜多糖溶液的吸光度分别为0.853。由附图1可知野生发菜多糖中的多糖含量为51.33%。
[0031]2.动物实验
[0032]2.1材料和方法
[0033]2.1.1样品性状:样品为野生发菜粗多糖，浅黄色。
[0034]2.1.2试验动物和饲料:实验选用BALB/c纯系小白鼠，合格证号:SCXK (京)2009-0017，雄性，5~7周龄，体重18~22g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，清洁级，饲料由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。[0035]2.1.3剂量设计:本次实验设计低、高两个剂量组，分别为50、100mg/kg *bw (bw体重)，对照组以生理盐水灌胃，灌胃容积为0.2ml/(10g.bw/d)。
[0036]2.2实验方法和结果
[0037]2.2.1野生发菜多糖对正常小鼠体重和脏器指数的影响(n=6)
[0038]实验结果见表1。在灌胃前一天、灌胃第7天、第14天，分别称小鼠体重并记录，灌胃14天后，将小鼠脱日处死，用75%乙醇浸泡3分钟，取脾脏、胸腺、肝脏，用0°C生理盐水漂洗，滤纸吸干，称重。
[0039]胸腺指数=胸腺重(mg) X 10/体重(g)(2-1)
[0040]脾脏指数=脾脏重(mg) X 10/体重(g)(2-2)
[0041]肝脏指数=肝脏重(mg) X 10/体重(g)(2-3)
[0042]表1野生发菜多糖对小鼠体重和脏器指数的影响(n=6)
[0043]
齐1J—量体重g脏器指数
组别(mg/
kg_d Od 7d 14d 脾指数胸腺指数肝脏指数_)_
空白组 -22.3±1.32 24.13±1.74 24.37±2.09 4.63±0.71 1.15±0.26 53.22 ±4.2
里予牛- 50 20.5±1.12 22.8±1.5 25.6±1.19 5.05±0.31 0.95±0.03 59.3±5.78发菜多糖
100 20.5±丄 / 23.0±0.83 23.78±1.64 5.16±0.79 0.92±0.03 54.61±5.22
[0044]经统计学分析野生发菜多糖小鼠体重较空白组没有显著差异。
[0045]野生发菜多糖组小鼠的脾较空白组有所升高，表明野生发菜能够一定程度地增加小鼠免疫器官的重量，提高机体免疫水平。
[0046]2.2.2野生发菜多糖对小鼠碳粒廓清指数的影响
[0047]结果见表2。从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每IOg体重0.1mL计算。待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20ul，并立即将其加到2mL0.l%Na2C03溶液中。用721分光光度计在600nm波长处测光密度值(0D)，以Na2CO3溶液作空白对照。
[0048]将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。按下式计算吞噬指数。
[0049]未经校正的吞噬指数K
r_0g 為-1g 為)
[0050]K - ----
(2-4)
[0051]校正的吞噬指数α
[0052]
a =_(65_χ\[κ
_重+脾脏重)(25)
[0053]表2野生发菜多糖对单核-巨噬细胞吞噬能力的影响组别剂量(mg/kg.d)吞噬指数a
1- ?空白组—5.57±0.20
[0054]
506,03 ±0.54
野生发菜多糖
1006.21 ±0.46*
[0055]*Ρ〈0.05与对照组相比(经方差分析)
[0056]经统计学分析，野生发菜多糖高剂量组与对照组相比，不能显著增加单核巨噬细胞吞噬指数。
[0057]2.2.3ΝΚ细胞活性测定
[0058]2.2.3.1LDH基质液的配制
[0059]乳酸锂5 X l(T2mol/L
[0060]硝基氯化四氮唑(INT)6.6X l(T4mol/L
[0061]吩嗪二甲酯 硫酸盐(PMS)2.8X 10_4mol/L
[0062]氧化型辅酶I (NAD) 1.3X l(T3mol/L
[0063]将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH8.2)混匀即可。
[0064]2.2.3.2靶细胞的传代(YAC-1细胞)
[0065]实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4 X IO5个/mL。
[0066]2.2.3.3脾细胞悬液的制备(效应细胞)
[0067]无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，或用Hank’s液洗2次，每次离心IOmin (1000r/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入8mL Hank’s液，lOOOrpm，离心lOmin，用ImL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95%以上)，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2 X IO7个/mL。
[0068]2.2.3.4NK细胞活性检测
[0069]取靶细胞和效应细胞各IOOyL (效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 μ L，靶细胞最大释放孔加靶细胞和I % ΝΡ40或
2.5%Triton各100 μ L ;上述各项均设三个复孔，于37°C、5%C02培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100 μ L置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μ L，反应3min，每孔加入lmol/L的HC130 μ L，在酶标仪490nm处测定光密度值(0D)。
[0070]按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活
性，即可判定该项实验结果阳性。
[0071]
_田胞活性c%)=α千裒=X ?_
最大释放扎OD -自繼放孔。D
[0072]由附图2可知，与空白组相比较野生发菜多糖能提高小鼠自然杀伤细胞的杀伤活性，并且低剂量组比高剂量组的效果好。这表明野生发菜多糖有提高机体非特异性免疫水平的作用。
[0073]2.2.4 二硝基氟苯诱导小鼠DTH (n=6)
[0074]结果见表3。
[0075]2.2.4.1 试剂配制
[0076]DNFB溶液:DNFB溶液应新鲜配制，称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5mL丙酮麻油溶液(丙酮:麻油=1:1)，倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250 μ L注射器通过瓶盖取用。
[0077]2.2.4.2致敏每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cmX3cm、用DNFB溶液50 μ L均匀涂抹致敏。
[0078]2.2.4.3DTH的产生与测定5d后，用DNFB溶液10 μ L均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24h颈椎脱白处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8_的耳片，称重。
[0079]表3发菜多糖对小鼠迟发型超敏反应的影响
[0080]
【权利要求】
1.一种发菜多糖作为制备免疫调节药物的用途。
2.根据权利要求1所述的发菜多糖作为制备免疫调节药物的用途，其特征在于:所述发菜多糖为从野生状态下发菜藻丝中提取的野生发菜多糖。
3.根据权利要求1所述的发菜多糖作为制备免疫调节药物的用途，其特征在于:所述发菜多糖来源于发菜细胞人工液体培养液的人工培养发菜多糖。
4.一种发菜多糖作为制备免疫调节保健品的用途。
5.根据权利要求4所述的发菜多糖作为制备免疫调节保健品的用途，其特征在于:所述发菜多糖为从野生状态下发菜藻丝中提取的野生发菜多糖。
6.根据权利要求4所述的发菜多糖作为制备免疫调节保健品的用途，其特征在于:所述发菜多糖来源于发菜 细胞人工液体培养液的人工培养发菜多糖。
【文档编号】A23L1/29GK103463121SQ201310357575
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】戴玉杰, 侯茂霞, 符宏磊, 贾士儒, 谭之磊, 岳利芳 申请人:天津科技大学