用于治疗肌肉萎缩症患者的寡核苷酸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人类遗传学领域，更具体地涉及用于设计单一寡核苷酸的方法，该单 一寡核苷酸优选地能够诱导前体mRNA(pre-mRNA)的两个或更多个外显子的跳读（略读， skipping)。本发明进一步提供所述寡核苷酸、包含所述寡核苷酸的药物组合物和如本文所 确定的所述寡核苷酸的应用。
【背景技术】
[0002] 寡核苷酸在医药中脱颖而出用于治疗遗传疾病如肌肉萎缩症。肌肉萎缩症 (Muscular dystrophy，MD)是指特征在于进行性无力和骨豁肌变性的遗传疾病。杜兴氏肌 肉萎缩症（Duchenne muscular dystrophy，DMD)和贝克氏肌肉萎缩症（Becker muscular dyStr〇phy，BMD)是最常见的儿童期形式的肌肉萎缩症，并且在本文中用于说明本发明。DMD 是严重的、致命的神经肌肉病症，其导致在12岁以前对轮椅支架的依赖性，并且DMD患者在 30岁以前常死于呼吸或心脏衰竭。
[0003] DMD由DMD基因中的突变引起；主要是移码缺失或一个或多个外显子重复 (duplication)，小核苷酸插入或缺失，或由无义点突变引起，其通常导致功能性抗肌萎缩 蛋白（肌营养不良蛋白，dystrophin)的缺乏。在过去十年期间，为了恢复DMD转录本的断 裂的阅读框，特异性诱导的剪接的修饰已新兴为用于杜兴氏肌肉萎缩症（DMD)的有希望的 治疗（van Ommen G. J.等人，Yokota Τ·等人，van Deutekom 等人，Goemans Ν· Μ·等人）。 使用序列特异性反义寡核苷酸（Α0Ν)，其靶向侧接（侧翼，flank)或含有突变的特定外显子 且干扰它的剪接信号，该外显子的跳读可以在DMD前体mRNA的加工过程中被诱导。尽管得 到截短的转录本，但恢复了开放阅读框并且引入了蛋白质，其类似于在通常较温和贝克氏 肌肉萎缩症患者中发现的那些。AON诱导的外显子跳读提供特定突变，和因此用于DMD患者 和特别严重BMD患者的潜在个性化治疗方法。由于大多数突变紧紧环绕DMD基因中的外显 子45至55,在其区域中的一个特定外显子的跳读可以用于具有各种突变患者亚群的治疗。 外显子51的跳读影响最大的患者亚群（约13% )，包括具有外显子45至50、48至50、50 或52的缺失的那些患者。对于一些突变，需要一个以上外显子的跳读恢复开放阅读框。例 如，对于具有DMD基因中外显子46至外显子50缺失的DMD患者，仅跳读外显子45和51将 是矫正性的。为了治疗这些患者，需要给予两种寡核苷酸、一种靶向外显子45而另一种靶 向外显子51。已广泛研宄在混合体（cocktail)中或在病毒递送的基因构建体中通过使用 AON的组合使两个或更多个连续外显子跳读的可行性（Aartsma-Rus A.等人，2004 ;B6roud C.等人；Van Vliet L.等人；Yokota Τ·等人；Goyenvalle Α·等人）。多外显子跳读将适 用于组合的患者亚群，允许模拟已知与相对温和表型相关的缺失，并且将提供工具来解决 DMD基因中热点缺失区域以外的稀有突变。对于开发包含多种寡核苷酸的药物的缺点是其 药品监管当局可以把不同序列的寡核苷酸作为不同的药物，每个都需要证明稳定的生产、 毒性和临床测试。因此，需要能够诱导至少两个外显子的跳读以促进治疗DMD患者的组合 子群的单分子化合物。
【具体实施方式】
[0004] 本发明提供用于设计单一寡核苷酸的方法，其中所述寡核苷酸能够结合到第一外 显子的区域并结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述 区域具有与所述第一外显子的所述区域具有至少50%的同一性。通过所述方法获得的寡核 苷酸优选地能够诱导所述前体mRNA的所述第一外显子和所述第二外显子的跳读。优选地， 也诱导另外的一个或多个外显子的跳读，其中所述另外的一个或多个外显子优选地位于所 述第一和所述第二外显子之间。所得到的所述前体mRNA的转录本（其中所述外显子被跳 读）是在框内的（in frame)。
[0005] 寡核苷酸
[0006] 在第一方面，本发明涉及寡核苷酸，其能够结合到第一外显子的区域并结合到相 同前体mRNA内的第二外显子的区域，其中所述第二外显子的所述区域具有与所述第一外 显子的所述区域具有至少50%的同一性。
[0007] 该寡核苷酸优选地能够诱导所述前体mRNA的所述第一和第二外显子的跳读；更 优选地诱导另外的一个或多个外显子的跳读，其中所述另外的一个或多个外显子优选地位 于所述第一和所述第二外显子之间，并且其中所得转录本是在框内的。
[0008] 外显子跳读干扰发生在真核细胞内的天然剪接过程。在高等真核生物中，细胞的 DNA中对于蛋白质的遗传信息被编码在外显子中，其通过内含子序列彼此分离。这些内含子 在某些情况下很长。真核生物的转录机制产生包含外显子和内含子的前体mRNA，同时常常 已在进行前体mRNA的产生期间，剪接机制在称为剪接的过程期间通过去除内含子并连接 存在于前体mRNA中的外显子产生用于蛋白质的实际编码mRNA。
[0009] 能够结合到来自前体mRNA的第一外显子的区域并结合到相同前体mRNA内的第二 外显子的区域的本发明的寡核苷酸被解释为适合于结合到来自前体mRNA的第一外显子的 区域并适合于结合到相同前体mRNA内的第二外显子的区域的寡核苷酸。当以前体mRNA使 用时或当与前体mRNA组合使用时，优选地在细胞内，本发明的此类寡核苷酸的特征在于它 的结合特征（即能够结合）。在此背景下"能够"可由"能"替换。因此，本领域技术人员 应当理解，能够结合到第一外显子的区域并能够结合到相同由核苷酸序列所限定前体mRNA 内的第二外显子的区域的寡核苷酸在结构上限定所述寡核苷酸，即所述寡核苷酸具有序 列，使得它与所述第一外显子的所述区域的序列反向互补并也与相同前体mRNA内所述第 二外显子的所述区域的序列反向互补。对于本申请的寡核苷酸所需要的所述第一和/或所 述第二外显子的所述区域反向互补的程度可小于100%。如本文进一步所提议的，可以允 许一定量的错配或一个或两个缺口。可以使用如后文所说明的本发明方法来设计具有与所 述第二外显子的所述区域至少50%同一性的第一外显子的区域的核苷酸序列（或具有与 所述第一外显子的所述区域至少50%同一性的第二外显子的区域的核苷酸序列），本发明 的寡核苷酸能够与其结合。优选的前体mRNA是抗肌萎缩蛋白前体mRNA。抗肌萎缩蛋白前 体mRNA的第一和第二外显子的优选组合和所述第一和第二抗肌萎缩蛋白外显子的优选区 域限定于表2中。本发明的寡核苷酸优选地能够诱导所述抗肌萎缩蛋白前体mRNA的所述 第一和第二外显子的跳读；更优选地诱导另外的一个或多个外显子的跳读，其中所述另外 的一个或多个外显子优选地位于所述第一和所述第二外显子之间，并且其中所得抗肌萎缩 蛋白转录本为在框内的，优选地如表1中。
[0010] 当转录本具有允许用于产生蛋白质的开放阅读框时，转录本为在框内的。可以通 过如本领域技术人员已知的测序和/或RT-PCR分析评估mRNA的框内状态。如本领域技术 人员已知的，可以使用与所述蛋白质交叉反应的抗体通过免疫荧光和/或蛋白印迹分析来 分析由框内转录本的翻译产生的所获得的蛋白质。贯穿本发明，如果由RT-PCR和/或测序 分析来确定所得框内转录本，或如果由免疫荧光和/或蛋白印迹分析来确定由所述框内转 录本产生的蛋白质，在取决于转录本同一性的相关体外或体内系统中，如本文所确定的寡 核苷酸可以说是功能性的。如后文所说明的，如果该转录本是抗肌萎缩蛋白转录本，相关系 统可以是健康供体或DMD患者的肌细胞，或肌管，或者肌肉纤维（muscle fiber)或肌纤维 (myofiber) 〇
[0011] 在实施方式中，第二外显子的区域（存在于与第一外显子的区域相同的前体mRNA 内）具有与如上所确定的第一外显子的区域至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%， 85%，90%，95%或100%的同一性（第一和第二抗肌萎缩蛋白外显子的优选区域确定于表 2中）。可在所述第一和/或第二外显子的整个长度上，或在如本文对于抗肌萎缩蛋白外显 子所示例说明的 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100、110、 120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个核苷酸的区域上评估同一性百分比。对 于本领域技术人员显然的是，如本文所确定的第一和第二外显子是一个单一前体mRNA的 两个不同外显子或在相同前体mRNA内的两个不同外显子。如本文所确定的第一外显子可 位于如本文所确定的相同前体mRNA内的第二外显子的上游（即，其5'端），或所述第二外 显子可以是位于所述第一外显子的上游。优选地，所述第一外显子位于从所述第二外显子 的上游。对于本领域技术人员显然的是，本发明的寡核苷酸可主要设计成能够结合到第一 外显子的区域；鉴于所述第一和所述第二外显子的区域的同一性，所述寡核苷酸也可以次 要地能够结合到所述第二外显子的所述区域。反向设计是可能的：本发明的寡核苷酸可以 主要设计成能够结合到第二外显子的区域；鉴于所述第一和所述第二外显子的区域的同一 性，所述寡核苷酸也可次要地能够结合到所述第一外显子的所述区域。
[0012] 可以在所述第一外显子的整个区域上评估第一外显子的区域和第二外显子的区 域之间的同一性百分比，其中该区域可以短于、长于或与本发明寡核苷酸能够结合的该区 域的部分同样长。如本文所用的第一外显子的区域和第二外显子的区域也可确定为一个或 多个同一性区域。优选地，限定与第二外显子的区域同一性的第一外显子的区域是同样长 或长于本发明的寡核苷酸能够结合的该区域部分。必须理解的是，本发明的寡核苷酸能够 结合到用于评估第一和/或第二外显子的序列同一性的所述区域的较小部分或部分重叠 部分。因此应当理解的是，能够结合到第一和第二外显子的区域的寡核苷酸可以结合所述 第一外显子和所述第二外显子的一部分所述区域。所述部分可以与所述第一和/或所述第 二外显子的所述区域一样长。所述部分可以短于或长于所述第一和/或所述第二外显子的 所述区域。所述部分可以包含在所述第一和/或所述第二外显子的所述区域内。所述部分 可以与所述第一和/或所述第二外显子的所述区域重叠。该重叠可以是在所述第一和/或 第二外显子的区域的5'和/或3'端的1、2、3、4、5或更多个核苷酸的重叠。寡核苷酸可以 长于或短于所述第一和/或所述第二外显子的区域至少1、2、3、4、5、或更多个核苷酸，并且 可以是在第一和/或第二外显子的所述区域的5'或3'端。
[0013] 该区域，为 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、或最高达 90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200 或更多核苷酸，用于计算在第一外显 子和第二外显子之间的同一性百分比，可以是连续延伸的或可以被一个、两个、三个、四个 或多个缺口（gap)中断，只要在整个区域上的同一性百分比为至少50%。
[0014] 可以使用本领域技术人员已知的任何程序评估第一外显子的区域和第二外显 子的区域之间的同一性百分比。优选地，如下评估所述同一性：使用在线工具EMBOSS Matcher，使用默认设置（Matrix :EDNAFULL，Gap_penalty : 16, Extend_penalty :4)在第一 和第二外显子之间最佳逐对对齐（pair-wise alignment)。
[0015] 如本文所使用的，寡核苷酸优选地是指能够结合于、靶向、杂交于、和/或反向互 补于相同前体mRNA内第一和第二外显