啶、5-(吡啶基酰胺）、5_异丁基、5-苯基，如在专利申请US 2013/0131141 (RXi)中 所描述的，通过引用将其全文结合于此；7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-氮杂-2, 6-二 氨基嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-2, 6-二氨 基嘌呤、超级G、超级A和M-乙基胞嘧啶或它们的衍生物；N2-环戊基鸟嘌呤（cPent-G)、 N2-环戊基-2-氨基嘌呤（cPent-AP)和N2-丙基-2-氨基嘌呤（Pr-AP)或它们的衍生物； 以及简并碱基或通用碱基如2, 6-二氟甲苯，或者不存在的碱基如脱碱基位点（例如1-脱 氧核糖、1，2-双脱氧核糖、1-脱氧-2-0-甲基核糖；或吡咯烷衍生物，其中环上氧被氮取代 (氮杂核糖））。超级A、超级G和超级T衍生物的实例可以见于美国专利US 6683173 (Epoch Biosciences)，通过引用将其全文结合于此。当并入siRNA中时，cPent-G、cPent-AP和 Pr-AP示出以减少免疫刺激作用（Peacock Η.等人），并且对于假尿嘧啶和NI-甲基假尿嘧 啶示出类似的特征（美国专利申请US 2013/0123481，modeRNA Therapeutics，通过引用将 其全文结合于此）。
[0067] 贯穿整个文档，'胸腺嘧啶'和'5-甲基尿嘧啶'可互换。以此类推，'2, 6-二氨基 嘌呤'与'2-氨基腺嘌呤'相同，并且这些术语可贯穿整个文档互换。
[0068] 在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含至少一个5-甲基胞嘧啶和/或至少 一个5-甲基尿嘧啶和/或至少一个2, 6-二氨基嘌呤碱基，其应当理解的是，所述寡核苷酸 的至少一个胞嘧啶核酸碱基已通过用甲基基团取代嘧啶环的5-位置上的质子而修饰（即 5-甲基胞嘧啶），和/或所述寡核苷酸的至少一个尿嘧啶核酸碱基已通过用甲基基团取代 嘧啶环的5-位置上的质子而修饰（即5-甲基尿嘧啶），和/或所述寡核苷酸的至少一个腺 嘌呤核酸碱基已通过用氨基基团取代2-位置上的质子而修饰（即2, 6-二氨基嘌呤）。在 本发明的背景中，表述"在嘧啶环的5-位置上用甲基基团取代质子"可由表述"用5-甲基 嘧啶取代嘧啶"替代，其中嘧啶仅涉及尿嘧啶、或仅胞嘧啶或两者皆有。同样地，在本发明的 背景中，表述"在腺嘌呤的位置2上用氨基基团取代质子"可由表述"用2, 6-二氨基嘌呤取 代腺嘌呤"替代。如果所述寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个胞嘧啶、尿嘧啶和/ 或腺嘌呤，则至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个胞嘧啶、尿嘧啶和/或腺嘌呤分别可被这种 方式修饰。在优选的实施方式中，所有的胞嘧啶、所有的尿嘧啶和/或所有的腺嘌呤已被这 种方式修饰或分别由5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤替代。
[0069] 发现在本发明的寡核苷酸中存在5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨 基嘌呤对所述寡核苷酸的至少一个参数或至少一个参数的改善具有积极影响。在这种情况 下，参数可以包括：如下所说明的所述寡核苷酸的结合亲和力和/或动力学、沉默活性、生 物稳定性、（组织内）分布、细胞摄取和/或运输和/或免疫原性。
[0070] 由于已知如上所提及的几个修饰增加 Tm值并且因此增强某种核苷酸与其靶mRNA 上的其配对物的结合，在本发明的背景中，可探索这些修饰以促进本发明的寡核苷酸与第 一和第二外显子的区域二者的结合。由于本发明寡核苷酸的序列不能100%反向互补于第 一外显子和/或第二外显子的给定区域，可以优选地在反向互补于所述外显子的所述第一 和/或所述第二区域的核苷酸位置处应用增加 Tm的修饰如桥接的核苷酸或BNA(如LNA) 或选自5-甲基嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤的碱基修饰。
[0071] 结合亲和力和/或结合或杂交动力学取决于AON的热力学性能。这些至少部分地 由以下项确定，所述寡核苷酸的恪融温度（Tm;用例如寡核苷酸性能计算器计算（http:// www.unc.edu/ ?cail/biotool/oligo/index.html 或 http://eu. idtdna.com/analyzer/ Applications/OligoAnalyzer/)，对于单链RNA使用基础Tm和最近邻模型），和/或寡核苷 酸-革巴外显子复合物的自由能（使用RNA structure版本4. 5或RNA mfold版本3. 5)。如 果增加 Tm，则外显子跳读活性通常增加，但当Tm太高时，预期AON成为较少序列特异性的。 可接受的Tm和自由能取决于寡核苷酸的序列。因此，难以给出对于这些参数中的每个的优 选范围。
[0072] 优选地如下限定本发明寡核苷酸的活性：
[0073] -缓解与存在于第一和/或第二外显子中的突变和/或存在于起始于所述第一并 结束于所述第二外显子的延伸中的突变有关的疾病的一种或多种症状，优选缓解一种或多 种DMD或BMD的症状；和/或
[0074] -缓解一个或多个来自患者的细胞、优选地来自患者的肌细胞的特征；和/或
[0075] -未所述个体提供功能性或半功能性蛋白质、优选地功能性或半功能性的抗肌萎 缩蛋白质；和/或
[0076] -至少部分地减少所述个体中异常蛋白质的产生，优选地至少部分地减少所述个 体中异常抗肌萎缩蛋白质的产生。已在后文中限定这些特征中的每个和用于评估它们的试 验。
[0077] 通过与无任何5-甲基胞嘧啶、无任何5-甲基尿嘧啶和无任何2, 6-二氨基嘌呤 碱基的寡核苷酸的相应活性相比，预期包含5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或 2, 6-二氨基嘌呤碱基的本发明的优选寡核苷酸示出增加的活性。在活性方面的这种差异 可至少为 1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。优选地至少部分地由改编自Yu等人，2002的 经验证的杂交连接试验确定生物分布和生物稳定性。在实施方式中，用特异性捕获寡核苷 酸探针孵育血浆或均质化的组织样本。分离之后，将DIG标记的寡核苷酸连接到复合物，并 且随后使用抗DIG抗体连接的过氧化物酶检测。使用WINNONLIN软件包（模型200,版本 5. 2,加拿大Mountainview的Pharsight)进行非间隔药代动力学分析。随着时间的推移监 测AON(Ug)每mL血衆或mg组织的水平以评估曲线下面积（AUC)、峰浓度（Cmax)、时间对峰 浓度（Tmax)、终末半衰期和吸收滞后时间（tlag)。已在实验部分中公开此类优选试验。
[0078] 寡核苷酸可以通过激活Toll样受体（TLR)(包括TLR9和TLR7)刺激先天免疫应 答（Krieg A.M.，等人，1995)。通常由于存在于寡脱氧核糖核苷酸（ODN)中的非甲基化CG 序列的存在而发生TLR9的激活，通过模拟细菌DNA其凭借TLR9介导的细胞因子释放激活 先天免疫系统。然而，2' -0-甲基修饰可显著减少此类可能的影响。已描述TLR7识别RNA 中的尿嘧啶重复（Diebold S. S.，等人，2006)。
[0079] TLR9和TLR7的激活引起一组协调的免疫应答，其包括先天免疫（巨噬细胞、树突 状细胞（DC)和NK细胞）（Krieg A. M.，等人，1995 ;Krieg A. M.，等人2000)。几种趋化因子 和细胞因子如 IP-KKTNFa、IL-6、MCP-1 和 IFNa (Wagner H.，等人，1999 ;Popovic P. J.， 等人，2006)已牵涉在该过程中。炎性细胞因子吸引来自血液的另外的防御细胞，如T细胞 和B细胞。可以通过体外测试研宄这些细胞因子的水平。简而言之，用增加浓度的寡核苷 酸来培养人全血，其后，由标准商购的ELISA试剂盒确定细胞因子的水平。在用包含至少一 个5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤的寡核苷酸处理的细胞中， 其相比于用不具有5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶或2, 6-二氨基嘌呤的相应寡核苷酸处理 的细胞，通过相比于试验中相应细胞因子的浓度，免疫原性的降低优选对应于上述至少一 个细胞因子浓度的可检测的降低。
[0080] 因此，通过相比于无 5-甲基胞喃啶、无 5-甲基尿喃啶且无 2, 6-二氨基嗓呤的相 应寡核苷酸，本发明的优选寡核苷酸具有改善的参数，如可接受的或降低的免疫原性和/ 或更好的生物分布和/或可接受或改善的RNA结合动力学和/或热力学性能。可以使用本 领域技术人员已知的试验评估这些参数中的每个。
[0081] 本发明的优选寡核苷酸包含RNA分子或修饰的RNA分子或由RNA分子或修饰的 RNA分子组成。在优选的实施方式中，寡核苷酸是单链的。然而本领域技术人员应当理解可 能的是，单链寡核苷酸可以形成内部双链结构。然而，在本发明的背景中，该寡核苷酸仍命 名为单链寡核苷酸。相比于双链siRNA寡核苷酸，单链寡核苷酸具有几个优点：（i)预期它 的合成易于两个互补的siRNA链；（ii)有更广范围的化学修饰可以增强细胞中的摄取、更 好的（生理学）稳定性并可以降低潜在一般性不利影响；（iii) siRNA具有对于非特异性作 用的更高可能性（包括脱靶基因）和夸大的药理学（例如，通过治疗计划或剂量控制有效 性和选择性较低的可能性），（iv) siRNA较少可能在细胞核中起作用并且不能针对内含子。
[0082] 在另一个实施方式中，本发明的寡核苷酸包含脱碱基位点或脱碱基单体。在本发 明的背景中，此类单体可称为脱碱基位点或脱碱基单体。通过相比于包含核酸碱基的相应 核苷酸残基，脱碱基单体是缺少核酸碱基的核苷酸残基或结构单元（building block)。在 本发明中，脱碱基单体是寡核苷酸但缺乏核酸碱基的结构单元部分。此类脱碱基单体可存 在于（present)或连接于（link)或附着于（attach)或结合于（conjugate)寡核苷酸的游 离末端。
[0083] 在更优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含1-10或多个脱碱基单体。因此， 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个脱碱基单体可以存在于本发明的寡核苷酸中。
[0084] 脱碱基单体可为由本领域技术人员已知和可想到的任何类型，其非限制性实例描 述如下：
[0085]
【主权项】
1. 一种反义寡核苷酸，用作用于预防、延缓、改善和/或治疗受试者的疾病的药物， 其中所述寡核苷酸能够结合到第一外显子的区域和第二外显子的区域，其中所述第二 外显子的所述区域具有与所述第一外显子的所述区域至少50%的同一性， 其中所述第一外显子和所述第二外显子在所述受试者的相同前体mRNA内， 其中所述结合引起所述第一外显子和所述第二外显子的跳读，优选地引起从所述第一 外显子开始并且包含存在于所述第一外显子和所述第二外显子之间的一个或多个外显子 的多外显子延伸的跳读，并且至多引起在所述第一外显子和所述第二外显子之间的外显子 的全部延伸的跳读，和 其中获得允许产生功能性或半功能性蛋白质的框内转录本。
2. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够诱导所述第一外显子和所述第 二外显子之间的所述外显子的全部延伸的跳读。
3. 根据权利要求1或2所述的反义寡核苷酸，其中所述结合能够干扰所述第一外显子 和第二外显子的所述区域中的至少一个剪接调控序列和/或干扰包含所述前体mRNA中的 至少所述第一外显子和/或所述第二外显子的二级结构。
4. 根据权利要求3所述的反义寡核苷酸，其中所述剪接调控序列包括用于丝氨酸-精 氨酸（SR)蛋白质的结合位点、外显子剪接增强子（ESE)，外显子识别序列（ERS)和/或外显 子剪接沉默子（ESS)。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的寡核苷酸，包含10至40个核苷酸。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸，与天然存在的基于核糖核苷酸或脱 氧核糖核苷酸的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸包含至少一种修饰，更优选地 (a) 至少一种碱基修饰，优选地选自2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、 5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、2, 6-二氨基嘌呤，更优选地选自5-甲基嘧啶和2, 6-二氨基嘌 呤；和/或 (b) 至少一种糖修饰，优选地选自2'-0-甲基、2'-0-(2-甲氧基）乙基、2'-0-脱氧 (DNA)、2' -F、吗啉代、桥接核苷酸或BNA，或者所述寡核苷酸包含桥接核苷酸和2' -脱氧修 饰