髓单核细胞的增值，生长曲线呈S型，没有加入M-CSF的单核细胞生长基本停滞。
[0023]以上实验表明M-CSF是骨髓单核细胞增殖的必要因子，药物贴壁筛选法是一种简便可靠、所需条件要求低、成本低、时间短的分离骨髓单核细胞的方法，提取的单核细胞纯度高。
[0024]实施例2骨髓单核细胞分化为破骨细胞的鉴定
细胞分离及培养方式同例1，取对数生长期的原代骨髓单核细胞用细胞刮刮下后以IX 14Cm2密度传代于12孔培养板中培养，置于培养箱内(37 °C、体积分数5%C0 2)培养4-6天，对照组和诱导组各3孔，其中对照组加入20ng/mL的M-CSF，诱导组加入20ng/mL的M-CSF 和 100ng/mL 的 RANKL，每 2 天换一次液。
[0025]1.破骨诱导培养4-6天，镜下观察到明显的多核融合的破骨细胞时行TARP染色，细胞用4%的多聚甲醛室温固定20分钟，在以萘酚AS-BI磷酸盐作为底物的孵育液中37°C孵育30min，去离子水清洗I次，DAPI染色液复染3 min，再用去离子水清洗3次，尽快Olympus 1X71倒置显微镜下拍照。
[0026]结果如图4所示，M- CSF和RANKL诱导培养后逐渐形成TRAP染色阳性的多核破骨细胞，DAPI染色显示破骨细胞的细胞核可多达20-50个，而对照组未见，仍为单核细胞。
[0027]2.破骨诱导培养4-6天，镜下观察到明显的多核融合的破骨细胞时行F-actin荧光染色，细胞4%多聚甲醛冰上固定10 min，PBS清洗细胞2次后，0.25%Triton (PBS稀释)室温孵育1min，PBS清洗2次，加入FITC-Phalloidin工作液(5 mg/L，1%的BSA稀释)室温避光孵育60min，PBS清洗3次，尽快Olympus 1X71倒置显微镜下观察拍照。
[0028]结果如图5所示，M-csf和RANKL诱导形成的多核破骨细胞形成了纤维性肌动蛋白环，而对照组可见单核细胞聚集，未见融合。
[0029]综上实验表明提取的骨髓单核细胞性状稳定，可成功的诱导分化为破骨细胞，可为医学基础及临床研究、组织工程研究等提供来源可靠稳定的C57BL/6小鼠骨髓单核细胞。
【主权项】
1.一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤: (A)无菌分离骨髓单核细胞，在20-100ng/mLM-CSF的完全培养基中培养，隔天换液，观察单核细胞的形态特征； (B)单核细胞密度为80-90%时，取出部分细胞行表面抗原鉴定； (C)其余细胞用于生长曲线的绘制及破骨细胞的分化诱导。
2.根据权利要求1所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于: 步骤(A)中观察单核细胞的形态特征为采用倒置显微镜记录单核细胞第1，3，5天的形态特征变化； 步骤(B)中表面抗原鉴定为采用流式细胞术检测分析单核细胞表面抗原CDllb的阳性表达率； 步骤(C)中生长曲线的绘制为采用MTT法测定单核细胞第1-5天的增殖情况，绘制生长曲线，分析M-CSF对单核细胞增殖的影响； 步骤(C)中破骨细胞的分化诱导为采用M-CSF和核因子K B受体活化因子配基进行分化诱导并用TRAP染色、F-actin荧光染色鉴定破骨细胞。
3.根据权利要求1或2所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于，所述的骨髓单核细胞取自C57BL/6小鼠。
4.根据权利要求1或2所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于，所述的完全培养基组分为α-ΜΕΜ为80~90%体积比，胎牛血清10~20%体积比，抗生素 10~200 U/mL。
5.根据权利要求2所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于，步骤(C)中分化诱导采用的M-CSF浓度为20-100ng/mL，RANKL为50_100ng/mL。
6.根据权利要求1所述的一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤: (I)骨髓单核细胞形态特征的观察，表面抗原的鉴定及生长曲线的绘制 无菌条件下取出C57BL/6小鼠双侧股骨和胫骨；超净台中剪开干骺端，用5mL无菌注射器，抽取无血清a -MEM培养液反复轻柔冲洗骨髓腔4次；10um细胞过滤器过滤后1200rpm离心5分钟，弃上清；加入10倍细胞体积的无菌IX红细胞裂解液，吹打混匀，在冰上裂解5分钟，100rpm离心5分钟，弃红色上清以去除红细胞；用无血清a -MEM培养液重悬沉淀洗涤2次；用含胎牛血清10%体积比，抗生素100 U/mL的a -MEM培养液5mL重悬骨髓细胞，接种于25cm2塑料培养瓶中，于37°C、5%C02培育箱静置培养过夜16小时；收集上清，并用无血清a -MEM培养液清洗培养瓶3次，1200rpm离心5分钟，用含胎牛血清10%体积比，抗生素100 U/mL, 100ng/mL M-CSF的a -MEM培养液1mL重悬单核细胞后接种于10mm培养皿中；培养2天后弃上清液，并用无血清a -MEM培养液清洗培养皿2次；加入含胎牛血清10%体积比，抗生素100 U/mL，100ng/mL的M-CSF的a-MEM培养液直至细胞增殖至密度为80%-90% ； Α.单核细胞第1，3，5天的形态特征变化 在细胞培养过程中，分别于第1，3，5天用德国zeiss倒置显微镜记录单核细胞的形态特征变化； B.单核细胞表面抗原⑶Ilb的阳性表达率 将生长状态良好的原代骨髓单核细胞用细胞刮刮下，计数后调成同一密度收集在2个EP管中，离心后去除培养基；2管分别加入1%BSA (用l%NaN3溶解)10uL冰上封闭30min，并标记1，2，I管为阴性对照，2管加入0.5μ L大鼠抗小鼠⑶Ilb荧光抗体，冰上静置反应30min ;离心后加入PBS清洗一次，每管加入600 μ L的1%的多聚甲醛，转移到流式管后上机检测； C.单核细胞在M-CSF刺激下的生长曲线 取对数生长期的原代骨髓单核细胞以1000/孔密度接种在96孔培养板中，分两组，一组加100ng/mL的M-CSF，另一组不加M-CSF，每6孔为一组，每孔100 μ L ;分别在接种后的第ld、2d、3d、4d、5d、以MTT法测细胞活力，其中加入M-CSF组每天换一次液；吸掉原培养液后每孔加入含有10%MTT溶液(5g/L)的培养液10uL继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液；每孔加入100 μ L DMSO溶液，振荡，镜下观察结晶物充分溶解后，在酶联免疫检测仪上测定各孔在570nm波长处的光吸收值，每组取6孔测定值的平均值；以天数为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线； (2)骨髓单核细胞分化为破骨细胞的鉴定 取对数生长期的原代骨髓单核细胞用细胞刮刮下后以I X 14Cm2密度传代于12孔培养板中培养，置于培养箱内(37 °C、体积分数5%C02)培养4-6天，对照组和诱导组各3孔，其中对照组加入20ng/mL的M-CSF，诱导组加入20ng/mL的M-CSF和100ng/mL的RANKL，每2天换一次液； 破骨诱导培养4-6天，镜下观察到明显的多核融合的破骨细胞时行TARP染色，细胞用4%的多聚甲醛室温固定20分钟，在以萘酚AS-BI磷酸盐作为底物的孵育液中37°C孵育30min，去离子水清洗I次，DAPI染色液复染3 min，再用去离子水清洗3次，Olympus 1X71倒置显微镜下拍照； 破骨诱导培养4-6天，镜下观察到明显的多核融合的破骨细胞时行F-actin荧光染色，细胞4%多聚甲醛冰上固定10 min, PBS清洗细胞2次后，0.25%Triton (PBS稀释)室温孵育lOmin，PBS清洗2次，加入FITC-Phalloidin工作液(5 mg/L，1%的BSA稀释)室温避光孵育60min，PBS清洗3次，Olympus 1X71倒置显微镜下观察拍照。
【专利摘要】本发明属于细胞提取、分化鉴定领域，公开了一种骨髓单核细胞提取及向破骨细胞分化的方法，包括以下步骤：（A）无菌分离骨髓单核细胞，在20-100ng/mLM-CSF的完全培养基中培养，隔天换液，观察单核细胞的形态特征；（B）单核细胞密度为80-90%时，取出部分细胞行表面抗原鉴定；（C）其余细胞用于生长曲线的绘制及破骨细胞的分化诱导。本发明的骨髓单核细胞的提取及向破骨细胞分化的方法简便可靠、所需条件要求低、成本低、时间短，提取的单核细胞性状稳定，可为医学基础及临床研究、组织工程研究等提供来源可靠稳定的C57BL/6小鼠骨髓单核细胞。
【IPC分类】C12N5-077
【公开号】CN104651302
【申请号】CN201510063630
【发明人】周龙, 何帆, 陈曦, 罗宗平, 杨惠林
【申请人】苏州大学附属第一医院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月9日