br>[0033] 步骤3HN016菌株的复壮：
[0034] 复壮方式是将HN016菌株从_80°C冰柜取出接种于TSB培养基培养，然后大剂量 注射一尾罗非鱼，待其发病后，再从脑组织中接种分离出病原菌，并加入500mlTSB培养基。 在28°C条件下振荡培养24h后，即得到用于大规模感染试验的菌液。
[0035] 步骤4 HN016菌株半数致死浓度的测定。：
[0036] 将步骤3培养好的HN016菌液用PBS溶液分别稀释至1. 0X108、1. 0X107、 1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0X103和 1.0X10 2CFU/尾六个不同浓度对同一个家 系相同规格的罗非鱼进行等量注射感染。结果显示1.0X105、1.0X104、1.0X103和 1. 0X102CFU/尾这四个感染剂量的累计死亡率均在75%以上，且死亡的试验鱼多数出现无 乳链球菌病的发病症状。死亡时间主要集中在12~72h，7d后基本停止死亡。通过计算， HN016菌株对试验鱼的半数致死浓度为7. 48X106CFU。筛选得到的HN016菌株的半数致死 浓度将用于各个罗非鱼选育世代的感染评估。临床HN016菌株腹腔注射感染罗非鱼试验结 果见附图2。
[0037] 步骤5人工注射感染HN016菌株：
[0038] 将待感染的罗非鱼置于预先清洁过的水池中，饲养一周左右。罗非鱼在感染前24h 禁食。根据HN016菌株的半数致死量和菌液浓度计算好每尾鱼注射菌液的体积，用连续注 射器将菌液注入罗非鱼的腹部。
[0039] 步骤6感染HN016菌株之后试验鱼的饲养管理；
[0040] 感染后水池须保持洁净，每隔1日更换半池水。水温用家热管控制在31°C左右，每 天按早中晚饲喂3次，每次按鱼体重的3%饲喂，并保证供氧充足。每隔3h统计一次死鱼的 数量，记录死亡个体的体重、体长、体高、体宽及死亡时间。
[0041] 步骤7感染HN016菌株后存活试验鱼的消毒处理：
[0042] 待试验鱼停止死亡后，再对其暂养20d，之后转入亲鱼培育池进行培育。入池之前 先用清水对实验鱼进行清洗，之后放入5毫克/升高锰酸钾溶液浸泡消毒lOmin。
[0043] 附表1:不同基因型代表菌株的毒力测定
[0044]
【主权项】
1. 一种基于罗非鱼育种抗病性能的评价方法，其特征在于，步骤如下： 步骤1感染菌株的选择： 利用特异PCR分子血清型鉴定和基因型分析的方法对前期分离到的169株罗非鱼无乳 链球菌菌株进行分析，共得到Ia、Ib、III型三种血清型以及A~M 13种带型，结合毒力测 定结果，发现HN016菌株为优势菌株，具有较强的毒力，且在罗非鱼养殖的几个主产区中均 分离到此菌株，因此，在进行罗非鱼抗病性能评估时，感染的菌株选择HN016菌株； 步骤2HN016菌株毒力稳定性检测： 随机挑选10管从养殖场分离得到的原代HN016菌株，进行革兰氏染色鉴定，确定为无 乳链球菌后进行_80°C冷冻保存，将HN016原代菌株与-80°C冷冻保存1个月、6个月、12个 月、2年、3年后的菌株进行人工感染检测其毒力的变化，结果表明冷冻保存后1个月、6个月 12个月、2年、3年的HN016菌株经过复壮后进行感染与HN016原代菌株相比并没有发生显 著变化，其毒力接近HN016原代菌株，说明HN016菌株毒力稳定性可靠，可以用于评估多个 罗非鱼选育世代的抗病性能； 步骤3HN016菌株的复壮： 复壮方式是将HN016菌株从-80°C冰柜取出接种于TSB培养基培养，然后大剂量注射 一尾罗非鱼，待其发病后，再从脑组织中接种分离出病原菌，并加入500ml TSB培养基，在 28°C条件下振荡培养24h后，即得到用于大规模感染试验的菌液； 步骤4HN016菌株半数致死浓度的测定： 将步骤3培养好的HN016菌液用PBS溶液分别稀释至I. 0X 108、I. 0X 107、I. 0X 106、 1.0 X 105、1.0 X 104、1.0 X IO3和LOX 10 2CFU/尾六个不同浓度对同一个家系相同规格的 罗非鱼进行等量注射感染，结果显示1. 0 X 1〇5、1. 0 X 1〇4、I. 0 XIO3和I. 0 X10 2CFU/尾这四 个感染剂量的累计死亡率均在75%以上，且死亡的试验鱼多数出现无乳链球菌病的发病症 状，死亡时间主要集中在12~72h，7d后基本停止死亡，通过计算，HN016菌株对试验鱼的 半数致死浓度为7. 48 X IO6CFU,筛选得到的HN016菌株的半数致死浓度将用于各个罗非鱼 选育世代的感染评估； 步骤5人工注射感染HNO16菌株： 将待感染的罗非鱼置于预先清洁过的水池中，饲养一周左右，罗非鱼在感染前24h禁 食，根据HN016菌株的半数致死量和菌液浓度计算好每尾鱼注射菌液的体积，用连续注射 器将菌液注入罗非鱼的腹部； 步骤6感染HNO16菌株之后试验鱼的饲养管理； 感染后水池须保持洁净，每隔1日更换半池水。水温用家热管控制在31°C左右，每天 按早中晚饲喂3次，每次按鱼体重的3%饲喂，并保证供氧充足。每隔3h统计一次死鱼的数 量，记录死亡个体的体重、体长、体高、体宽及死亡时间； 步骤7感染HNO16菌株后存活试验鱼的消毒处理： 待试验鱼停止死亡后，再对其暂养20d，之后转入亲鱼培育池进行培育。入池之前先用 清水对实验鱼进行清洗，之后放入5毫克/升高锰酸钾溶液浸泡消毒lOmin。
【专利摘要】本发明公开了一种基于罗非鱼育种抗病性能的评价方法。通过感染菌株的选择、HN016菌株毒力稳定性检测、HN016菌株的复壮、HN016菌株半数致死浓度的测定、人工注射感染HN016菌株、感染HN016菌株之后试验鱼的饲养管理和感染HN016菌株后存活试验鱼的消毒处理步骤对每个选育世代的罗非鱼育种抗病性能进行评价。本发明方法优点：1.本发明具有针对性强、筛选效率高，效果明显等特点，利用该方法能够筛选出抗病力强的罗非鱼个体或家系用于进一步选育。2.本发明为其他鱼类的抗病育种提供了一种新的评价方法，对开展鱼类抗病育种研究具有重要的指导。
【IPC分类】C12Q1-18
【公开号】CN104651472
【申请号】CN201510006537
【发明人】朱佳杰, 陈明, 敖秋桅, 甘西, 刘溪, 谭芸, 周宇
【申请人】广西壮族自治区水产科学研究院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月18日