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[0044] 具体步骤如下所述：
[0045] (1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2ml离心管中；
[0046] (2)加入裂解液（自己配备）800 μ L，及蛋白酶K 30 μ L (Omg/ml);
[0047] (3)样品置于55°C恒温箱中孵育过夜，至管中无组织块为止；
[0048] (4)加入 Tris 饱和酚 800 μ L，轻微混匀 lOmin，4°C 12000r/min 离心 12min ;
[0049] (5)取650 μ L上清加 Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1) 800 μ L，混摇lOmin， 4°C 12000r/min 离心 12min ;
[0050] (6)取 550 μ L 上清，加氯仿 800 μ L，混摇 lOmin，4°C 12000r/min 离心 12min ;以下 步骤换I. 5ml的离心管
[0051] (7)取450以1^上清，加无水乙醇80(^1^31乙酸钠4(^1^混摇61^11，4°〇10001·/ min 离心 8min ;
[0052] (8)弃上清留下DNA沉淀团，加入1000 μ L 70 %乙醇（自己配备），混摇5min， 4°C 1000r/min离心5min，弃上清（如需要可重复一次）；
[0053] (9)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；
[0054] (10)样品加100 μ L超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过Nanodrop - 100分光光度 计检测质量与浓度后将浓度同一稀释到50ng/ μ L于-20°C下保存备用。
[0055] 3、猪全基因组6万个^OK) SNP基因型检测
[0056] 上述个体的DNA在Illumina Beadstation平台上根据公司标准流程进行猪全基 因组60KSNP(Illumina，美国）基因型判定。利用PLINK(1.9)对所有样本60K芯片数据进 行质量控制，剔除检出率低于〇. 95、家系孟德尔错误率高于0. 05的个体；最小等位基因频 率小于0. 05的SNP标记。
[0057] 4、全基因组关联（GWAS)分析
[0058] 使用PLINK(1. 9)软件对分型个体的60K SNP标记型数据和窝总产仔数表型数据 进行GWAS分析，采用Bonferroni校正法控制多重检验，将基因组显著性阈值确定为0. 05/ 标记数。GWAS的结果显示，猪3号染色体上存在1个与窝产总仔数显著相关的SNP位点（图 1)〇
[0059] 实施例2
[0060] 本实施例为实施例1中得到的SNP位点g. 14734925G/T在二花脸母猪群体内的验 证。
[0061] 1、提取二花脸母猪基因组DNA
[0062] 采集具有准确窝总产仔数记录的132头纯种二花脸母猪的耳组织样品，放置于装 有70%酒精的离心管内，-20°C冰箱保存备用。利用上述方法提取耳组织基因组DNA，经过 质量、浓度检测后将浓度稀释到30ng/yL于-20°C下保存备用。
[0063] 2、目的片段PCR扩增与测序
[0064] 用已提取的DNA为模板，根据所设计的引物，进行PCR扩增：取DNA模板2. 5 μ L、 SEQ ID NO :2 和 SEQ ID NO :3 所示的引物各 L 25 μ L、PCR Mix 试剂 25 μ L、双蒸水 20 μ L ; 设置PCR扩增体系：预变性96°C 2min ;变性96°C 20s ;退火55°C 30s ;延伸72°C 45s ;35个 循环；然后延伸l〇min。
[0065] PCR产物在1. 2 %琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小为512bp，电泳图 见图2,将剩余的扩增产物进行测序，测序结果用DNAman软件与GenBank中猪的相关基因片 段序列比对、分析，判读g. 14734925G/T的基因型，然后利用SAS软件进行基因型对表型的 影响效应分析。分析模型为Yijklm= u+G j+Bk+Pfeij^
[0066] 其中：Yijkn^猪的产仔数；G』代表第j个SNP的基因型固定效应；B k是第k个批次 固定效应；P1是胎次的随机效应，不同胎次的产仔数记录作为重复数据处理；e ijklmS残差。
[0067] 显著性的P值经过10000次的随机抽样校正。
[0068] 表1给出了 g. 14734925G/T突变位点在纯种二花脸群体中对窝总产仔数的影响效 应。由表1可知，纯种二花脸猪中，g. 14734925G/T位点的TT基因型个体与GG型个体相比 较：窝总产仔数平均增加1.66头。由此可见，在二花脸猪种中，继代选育g. 14734925G/T位 点的TT型均可逐步提高二花脸母猪的窝总产仔数，达到提高二花脸母猪繁殖性能的目的。
[0069] 表1、g. 14734925G/T SNP位点与二花脸母猪窝总产仔数的关联分析
[0070]
【主权项】
1. 一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记，其特征在于所述SNP标记位于猪3号 染色体上的孤独症易感基因AUTS2的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组 10. 2版本参考序列猪3号染色体上g. 14734925核苷酸位点，且存在G/T多态性，所述SNP 标记与二花脸母猪窝产总仔数极显著相关。
2. -种基于权利要求1所述的SNP开发分子标记的方法，其特征在于以含有权利要求 1所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以二花脸母猪基因组DNA为模板 进行PCR扩增，使权利要求1所述的SNP标记转化为分子标记。
3. 根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述的引物对序列为上游引物：SEQID NO:2,下游引物：SEQIDNO:3;所述的分子标记序列如SEQIDNO:1所示，所述的SNP位点 位于第535位，存在G/T多态性。
4. 按照权利要求2或3的方法得到的分子标记。
5. 根据权利要求4所述的分子标记，其特征在于分子标记序列如SEQIDNO: 1所示， 所述的SNP位点位于第535位，存在G/T多态性。
6. -种用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物对，其特征在于上游引物为：SEQID NO:2,下游引物为：SEQIDNO:3。
7. -种检测权利要求1所述的SNP标记的方法，其特征在于包含PCR扩增二花脸母猪 基因组中含有权利要求1所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的 G/T多态性。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 取一头二花脸母猪的耳组织样品并提取总DNA; (2) 用已提取的二花脸母猪基因组DNA为模板，使用权利要求5所述的引物进行PCR扩 增； (3) 扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在SEQIDNO:1第535位的G/T多态性。
9. 权利要求1所述的SNP标记、权利要求4或5所述的分子标记、权利要求6所述的引 物在筛选高产二花脸母猪品系中的应用。
10. -种筛选高产二花脸母猪品系的方法，其特征在于包括检测二花脸母猪 g. 14734925核苷酸位点的基因型，选育g. 14734925核苷酸位点的TT型个体作为种猪。
【专利摘要】本发明公开了一种与二花脸母猪产仔性状相关的SNP标记及其检测方法。所述SNP标记位于猪3号染色体上的孤独症易感基因AUTS2的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪3号染色体上g.14734925核苷酸位点，且存在G/T多态性，所述SNP标记与二花脸母猪窝产总仔数极显著相关。一种用于检测本发明所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQ ID NO：2，下游引物为：SEQ ID NO：3。本发明提供的SNP标记与二花脸母猪的产仔性能相关，因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选高产的二花脸母猪品系，所得的二花脸母猪高产品系具有重要的经济效益与社会价值。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104726577
【申请号】CN201510114373
【发明人】黄瑞华, 贺丽春, 李平华, 周波, 马翔
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月16日