用于辛德比斯病毒荧光rt-pcr检测的引物和lna探针及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及用于辛德比斯病毒荧光RT-PCR检测 的引物和LNA探针及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 辛德比斯病毒（Sindbis virus, SINV)属于披膜病毒科甲病毒属，为甲病毒属的代 表株。1952年首次分离于埃及尼罗河三角洲辛德比斯地区采集的库蚊中，命名为AR339株。 库蚊和伊蚊是其传播媒介，鸟类和家畜等脊椎动物为其宿主。辛德比斯病毒感染为人畜共 患病，可引起人体发热、头痛、皮瘆、关节炎甚至脑炎，与登革热、基孔肯雅热等其他虫媒病 毒病症状类似。本病在世界上广泛流行，非洲、亚洲、欧洲和大洋洲都有发生，印度、南非、澳 大利亚、俄罗斯和亚洲许多国家均从库蚊样本中分离到该病毒。辛德比斯病毒根据抗原性 不同可分为两个组，一组为古北区（欧洲、喜马拉雅山和长江直到其人海口以北的亚洲、阿 拉伯北部、撒哈拉大沙漠以北的非洲）_埃塞俄比亚区，另一组为东方区-澳大利亚区。根 据核苷酸序列同源性分析，目前世界上已发现的辛德比斯病毒可分作亚洲/澳洲与欧洲/ 非洲两大支系。
[0003] 随着与世界各国交通往来的日益频繁，境外一些来自疫区的人员和传播媒介蚊类 可通过国境口岸进入我国，存在着随交通工具将辛德比斯病毒输入我国的风险。因此，在国 境口岸建立一套针对人群和蚊类携带辛德比斯病毒的检验鉴定方法，是检验检疫机关迫切 而重要的工作内容之一。
[0004] LNA (Locked Nucleic Acid)是一种核酸类似物，和普通核酸分子区别在于在其碳 环的2'氧原子和4'碳原子位置引入亚甲基桥形成锁状结构，因此也称锁核酸。引入一个 LNA碱基可对探针的TM值提高3-8摄氏度，可以大大缩短TaqMan探针的长度，从而大大增 加探针的灵敏度及稳定性，可使探针信号增强、信噪比增大。因此，选用LNA探针可以提高 检测灵敏度和稳定性。为及时掌握国境口岸人群中疑似病例或媒介是否携带辛德比斯病 毒，有效地控制该类传染病在国境口岸的传入和输出，保障广大人民群众的生命与健康，需 要建立一种实时、灵敏、稳定快速的检测鉴定手段，对在国境口岸积极有效防控辛德比斯感 染疫情、服务地方经济和公共卫生事业发挥重要的现实作用。
【发明内容】
[0005] 为克服上述技术缺陷，本发明提供了用于辛德比斯病毒荧光RT-PCR检测的引物 和LNA探针及其试剂盒。该引物探针和试剂盒可以实现对辛德比斯病毒灵敏快速简便的检 测。
[0006] 本发明的用于辛德比斯病毒荧光RT-PCR检测的引物和探针，所述引物序列如SEQ ID NO : 1-2所示，所述LNA探针序列如SEQ ID NO :3所示。
[0007] 本发明的一种用于辛德比斯病毒荧光RT-PCR检测的试剂盒，包括无 RNA酶的灭菌 双蒸水、RT-PCR缓冲液、RT-PCR酶混合液、阳性对照模板、阴性对照模板，还包括引物和LNA 探针，所述引物的核酸序列如SEQ ID NO :1-2所示；所述LNA探针的核酸序列如SEQ ID NO: 3所示，引入LNA的碱基用下划斜体字母表示。具体序列如表1所示，表1是辛德比斯病毒 实时荧光RT-PCR检测的引物和LNA探针列表。
[0008] 表 1
[0009]
【主权项】
1. 用于辛德比斯病毒荧光RT-PCR检测的引物和LNA探针，其特征在于，所述引物序列 如SEQ ID NO : 1-2所示，所述LNA探针序列如SEQ ID NO :3所示。
2. -种用于辛德比斯病毒荧光RT-PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括无 RNA酶的灭菌 双蒸水、RT-PCR缓冲液、RT-PCR酶混合液、阳性对照模板和阴性对照模板，其特征在于，还 包括引物和LNA探针； 所述引物序列如SEQ ID NO : 1-2所示； 所述LNA探针序列如SEQ ID NO :3所示。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述LNA探针序列5' -FAM-C ￡ A 4 A I： GA ￡< C 4 T G C - BHQ1-3'中用下划斜体字母表示的碱基是LNA碱基。
【专利摘要】本发明公开了一种用于辛德比斯病毒荧光RT-PCR检测的引物和LNA探针及其试剂盒。本发明的用于辛德比斯病毒荧光RT-PCR检测的引物，序列如SEQ ID NO：1-2所示，探针序列如SEQ ID NO：3所示。本发明的试剂盒，包括无RNA酶的灭菌双蒸水、RT-PCR缓冲液、RT-PCR酶混合液、阳性对照模板、阴性对照模板，还包括引物和LNA探针，所述引物的序列如SEQ ID NO：1-2所示；所述探针的序列如SEQ ID NO：3所示。本发明为辛德比斯病毒的实时荧光RT-PCR检测，特别是为国境口岸人群及蚊类携带辛德比斯病毒的实时荧光RT-PCR检测提供了灵敏特异快速简便的检测方法。
【IPC分类】C12N15-11, C12R1-93, C12Q1-68, C12Q1-70
【公开号】CN104726615
【申请号】CN201510172263
【发明人】洪烨, 郑夔, 戴俊, 袁帅, 师永霞, 黄吉城
【申请人】广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月13日