[0078]I)分别用含20% (体积分数)Front胎牛血清、原代细胞培养专用血清的2 X MDM培养基将经免疫磁珠分选获取的Lin-细胞悬起，调细胞终浓度为2 X 15个/mL，根据分组加入不同的细胞因子混匀(每组加入的细胞因子情况见下述步骤)，细胞悬液与等体积的3%甲基纤维素混匀。
[0079]2)将上述细胞悬液，接种到12孔板中，每孔2mL，细胞终浓度为I X 15个/mL。分组:A、con ;B、SCF+FLT-3L ;C、SCF+IL-3+FLT-3L+GM-CSF ;D、SCF+IL-3+FLT-3L+M-CSF ；每组2复孔，37°C、5% 0)2培养箱中培养。细胞因子浓度为SCF:20ng/mL ;FLT_3L:10ng/mL ；IL-3:10ng/mL ;GM_CSF:20ng/mL ;M_CSF:20ng/mLo
[0080]3)每天镜下观察克隆形成情况并拍照。
[0081](五)骨髓Lin-细胞与0P9-DL1共孵育:
[0082]I)在共孵育之前24h，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为I X 15个/mL,取Iml接种于12孔细胞培养板(OP9-DL1常规用含10%体积分数Front胎牛血清的a -MEM培养基培养)中，当细胞融合度达到80%时(图1)，0P9-DL1细胞上清吸弃，进行骨髓Lin-细胞与0P9-DL1共孵育实验。
[0083]2)将2χ106个经免疫磁珠分选获取的Lin-细胞分别悬浮于含20% (V/V) Front血清的MDM培养基，及含20% (V/V)原代细胞专用血清的MDM培养基中混匀，调细胞浓度为IxlO5个/mL，取2mL细胞悬液，接入上述吸弃上清后的0P9-DL1细胞，加入培养板中，加入 FLT-3L(5ng/mL)和 IL-7 (5ng/mL)，5% CO2、37°C细胞培养箱中培养。
[0084]3)培养48h，将培养板中扩增的Lin-细胞用移液器吹打后经400目筛网过滤至50mL离心管中(去除0P9-DL1细胞)，350g离心6min收集细胞沉淀。
[0085]4)分别用上述2)两种含不同血清的培养基将细胞悬起，调细胞浓度为IxlO5个/mL,取2mL细胞悬液，接入新的融合率达80%的0P9-DL1单细胞层，将2mL细胞悬液加入各孔中，并补充 FLT-3L (5ng/mL)和 IL-7 (5ng/mL)。
[0086]所述新的0P9-DL1单细胞层是通过以下方法制备得到的:0P9_DL1细胞用含10%(体积分数)胎牛血清(Front胎牛血清)的a -MEM培养基培养，将0P9-DL1细胞消化后调细胞浓度为I X 15个/mL，取Iml接种于12孔板中，当细胞融合率达80%时，吸弃上清，即得;
[0087]5)每3?4天更换一次新的0P9-DL1单细胞层以扩增Lin-细胞，并加入FLT-3L(5ng/mL)和 IL_7(5ng/mL)。
[0088](六)流式细胞仪观察骨髓Lin-细胞向T细胞的分化:
[0089]I)将细胞培养板中的骨髓Lin-细胞经400目筛网过滤，收集于流式管内。
[0090]2) 350g离心6min收集细胞沉淀，混勾，加入10 μ L大鼠血清，4°C封闭30min。
[0091]3)加入 0.3 μ L PE-ant1-Mouse CD25 和 0.3 μ L APC-ant1-Human/Mouse CD44 抗体，避光，4°C孵育30min。
[0092]4)加入2mL lxPBS，350g离心6min，洗去未结合的抗体。
[0093]5)加入适量IxPBS悬起细胞沉淀，上机检测。
[0094]结果:
[0095](一 )不同血清对骨髓单个核细胞集落形成能力的影响
[0096]图2、图3显示骨髓单个核细胞培养至7天时，镜下观察Gibco胎牛血清、Bovogen胎牛血清、Front胎牛血清、四季青胎牛血清和原代细胞培养专用血清组对集落形成的影响(图2为原代细胞培养专用血清培养组，图3为Front胎牛血清培养组，Gibco胎牛血清、Bovogen胎牛血清和四季青胎牛血清培养组细胞状态与Front胎牛血清培养组相似，图略)，SCF+IL-3+FLT-3L+GM-CSF 和 SCF+IL-3+FLT-3L+M-CSF 组合(C 组、D 组)中，前四种血清每孔一般可见50个左右集落，集落中细胞数多为50到200个左右，原代专用血清每孔可见80个左右集落，且后者集落比前者大，集落中细胞数多为300个以上，后者集落中细胞与前者相比形态饱满、透明度高、生长状态良好，五种血清组集落类型多为粒系或巨噬系(CFU-GM) ο
[0097]( 二 )两种血清对骨髓Lin-细胞集落形成能力的影响
[0098]Lin是Lineage (系)的缩写，Lin-细胞是指HSC还没有定向分化为红系、髓系、巨核和淋巴系细胞的造血前体细胞，经免疫磁珠分选试剂盒分离后的Lin-细胞可达95%以上，极大的富集了目的细胞，图4显示，Lin-细胞扩增至14天时，原代培养专用血清组可见细胞集落形成，此集落中细胞较分散，未见明显的血岛样结构，但细胞状态良好。图5显示，Front血清组未形成明显的集落且细胞碎片较多、状态较差。表明原代细胞专用血清对Lin-细胞具有较强的促增殖效应。
[0099](三)骨髓HSC向T细胞分化的流式分析
[0100]0P9-DL1细胞具有分泌IL-2、IL-7等细胞因子的功能，可作为骨髓HSC的滋养细胞，本发明采用0P9共孵育体系进一步诱导HSC细胞由造血前体细胞向T细胞方向的转化实验。
[0101]采用Front血清配制的培养基进行共孵育实验，骨髓单个核细胞只能培养到7天左右，继续培养细胞停止增殖，死亡或凋亡细胞明显增加，故仅能在第7天进行细胞的流式分析(图6)。
[0102]采用原代细胞培养专用血清配制的培养基进行共孵育实验，骨髓单个核细胞状态良好，增殖明显。图7显示，在IL-7和FLT-3L的诱导下，培养至第13天和20天，HSC逐渐由造血前体细胞向T细胞转化(即细胞从DN2/DN3阶段向DN3/DN4转化，DNl:CD44+CD25-，DN2:⑶44+CD25+，DN3:⑶44XD25+，DN4:⑶44XD250，本研宄结果与国外相关文献(参考文献:Wang H，Pierce LJj Spangrude GJ.Distinct roles of IL-7 and stem cell factor in the0P9-DL1 T-cell differentiat1n culture system.Exp Hematol 2006;34:1730-40.)报道类似，提示原代细胞培养专用血清与其他胎牛血清相比更适合于HSC的扩增与诱导转化。
【主权项】
1.原代细胞培养专用血清在诱导小鼠骨髓造血干细胞(HSC)定向分化为T细胞中的应用，其特征在于:所述原代细胞培养专用血清是通过以下方法制备得到的:将胎牛脐带血室温静置12h后分离收集血清，将每头份血清依次进行内毒素、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体检测，将检测结果均为阴性的血清混合，0.1 ym微孔滤膜过滤除菌并分装，-20°C保存即可。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述骨髓HSC为小鼠骨髓HSC。
3.一种利用原代细胞培养专用血清诱导骨髓造血干细胞定向分化为T细胞的方法，其特征在于:步骤如下: (1)0P9-DL1细胞用含10%(体积分数)胎牛血清的α-ΜΕΜ培养基培养，将OP9-DL1细胞消化后调细胞浓度为I X 15个/mL,取Iml接种于12孔板中，当细胞融合率达80?90%时，吸弃上清，加入经免疫磁珠分选后的骨髓Lin-细胞，用含20% (体积百分数)原代细胞培养专用血清的頂DM培养基将骨髓Lin-细胞悬起，调整骨髓Lin-细胞终浓度为I X 15个/mL，接入培养板中，加入终浓度为5ng/mL的FLT-3L和5ng/mL的IL-7，5% C02、37°C细胞培养箱中培养； (2)培养48h后，培养板中的细胞用移液器吹打后经400目筛网过滤至50mL离心管中，350g离心6min收集细胞沉淀； (3)用含20%原代细胞培养专用血清的MDM培养基悬起细胞沉淀，调细胞浓度为IX 15个/mL，取2ml细胞悬液，接入新的OP9-DL1单细胞层，并补充FLT-3L至终浓度为5ng/mL，补充IL-7至终浓度为5ng/mL，5% CO2、37°C细胞培养箱中培养； 所述新的0P9-DL1单细胞层是通过以下方法制备得到的:0P9-DL1细胞用含10% (体积分数)胎牛血清的a -MEM培养基培养，将0P9-DL1细胞消化后调细胞浓度为I X 15个/mL，取Iml接种于12孔板中，当细胞融合率达80?90%时，吸弃上清，即得； (4)每3?4天更换一次新的0P9-DL1单细胞层，并补充FLT-3L至终浓度为5ng/mL，补充IL-7至终浓度为5ng/mL，5% CO2、37°C细胞培养箱中培养；培养13?20天，骨髓Lin-细胞即定向分化为T淋巴细胞，即得T细胞； 所述原代细胞培养专用血清是通过以下方法制备得到的:将胎牛脐带血室温静置12h后分离收集血清，将每头份血清依次进行内毒素、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体检测，将检测结果均为阴性的血清混合，0.1 ym微孔滤膜过滤除菌并分装，-20°C保存即可。
4.根据权利要求3所述的用原代细胞培养专用血清诱导骨髓造血干细胞定向分化为T细胞的方法，其特征在于:所述骨髓造血干细胞是通过以下方法得到的: (一)骨髓单个核细胞的获取: 1)取新鲜处死的动物，分离四肢并剥离表皮后于IXPBS中，剪其双脚后用纱布包裹揉搓除去胫骨及股骨所粘附的肌肉组织； 2)将分离的胫骨及股骨用IXPBS清洗两遍，剪断两端使骨髓腔相通； 3)用注射器将骨髓腔中骨髓冲出，反复冲洗直至骨髓腔变白； 4)将冲出的骨髓细胞悬液过200目钢网，去除残余的骨组织或其他残渣； 5)细胞悬液收集到离心管中，1200rpm，10min，4°C离心，同样条件IXPBS再洗一次； 6)红细胞裂解液裂解红细胞，IXPBS洗一次，离心，细胞沉淀即为小鼠骨髓单个核细胞； (二)免疫磁珠分选Lin-细胞: 1)将上述所获小鼠骨髓单个核细胞悬液离心，300g，10min，弃上清； 2)细胞沉淀每17细胞加入40uLPBE缓冲液； 3)每17细胞加入1uL生物素标记的抗体； 4)混匀，4?8°C孵育1min； 5)每17细胞加入30uLPBE缓冲液； 6)每17细胞加入20uL抗生物素磁珠； 7)混匀，4?8°C孵育15min； 8)离心:300g，lOmin，弃上清； 9)每18细胞加入500uLPBE缓冲液； 10)进行磁珠分选，流出的细胞为Lin-细胞。
5.根据权利要求3或4所述的用原代细胞培养专用血清诱导骨髓造血干细胞定向分化为T细胞的方法，其特征在于:所述骨髓造血干细胞为小鼠骨髓造血干细胞。
【专利摘要】本发明为促进小鼠骨髓造血干细胞体外克隆形成及分化能力的方法，在HSC细胞体外克隆形成及诱导定向分化实验中，血清质量是影响HSC扩增及生长状态的重要因素，本研究将原代细胞培养专用血清用于小鼠HSC克隆形成及定向分化实验，并与国内外四种胎牛血清进行了对比。采用免疫磁珠分离骨髓Lin-细胞，并进行集落形成实验，培养至14天，本血清可见疏松型集落形成，其他血清无集落形成。流式分析骨髓Lin-细胞向T细胞分化结果显示，其他血清培养至7天时，细胞死亡及凋亡严重，流式分析无法观察到细胞从DN2向DN4转化过程，而本血清培养至13天和20天时，骨髓Lin-细胞由DN2/DN3阶段逐渐向DN3/DN4阶段转化，动态显示HSC由造血前体细胞逐渐向T淋巴细胞转化的过程，本研究结果与国外相关文献报道一致，表明本血清具有促进HSC扩增及定向分化的生物学效应。
【IPC分类】C12N5-0789, C12N5-0783
【公开号】CN104789529
【申请号】CN201510208722
【发明人】张龙, 张彩, 陈帅, 王丽娜, 张建华
【申请人】济南劲牛生物科技有限公司, 山东大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月28日