计算优化的广泛反应性h1n1流感抗原的制作方法
【专利说明】
[0001] 交叉引用相关申请
[0002] 本申请要求2012年11月27日提交的美国临时申请号61/730, 186的权益，在此 整体引入该申请的内容。
技术领域
[0003] 本公开涉及优化的流感血凝素蛋白，该流感血凝素蛋白对H1N1病毒分离物引起 广泛的反应性免疫应答，以及该流感血凝素蛋白作为疫苗的使用。
【背景技术】
[0004] 流感病毒是正粘病毒科的成员。有3个亚型的流感病毒，分别命名为A型流感病 毒，B型流感病毒和C型流感病毒。流感病毒的病毒粒子含有分段的负股（negative-sense) 的RNA基因组，其编码下列蛋白：血凝素（HA)、神经氨酸酶（NA)、基质（M1)、质子离子通道 蛋白（M2)、核蛋白（NP)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白 (PA)、非结构蛋白2 (NS2)。HA、NA、Ml和M2为膜相关蛋白，而NP、PB1、PB2、PA和NS2为核 衣壳相关蛋白。在流感病毒粒子中Ml蛋白是最丰富的蛋白。HA和NA蛋白为包膜糖蛋白， 负责病毒的附着和病毒粒子渗入细胞，并且对于病毒中和和保护性免疫来说是主要的免疫 显性表位来源。HA和NA蛋白两者都被认为是预防性流感病毒疫苗的最重要成分。
[0005] 每年，仅在美国，季节性流感都会导致超过300, 000人住院和36,000人死亡 (Simonsen等，LancetInfectDis7:658-66,2007)。在 2009 年，新流感病毒H1N1 的出现 演示了新的流感大流行能够如何迅速地席卷全球。
[0006] 目前，在美国有两种许可的流感疫苗方式，分别为灭活的裂解疫苗和减毒活疫苗。 灭活疫苗可以有效地诱导体液免疫应答，但通常不能很好地引起细胞免疫应答。因为可能 会增加感染的风险，活毒疫苗不能施用于免疫功能低下者和怀孕的病人。因此，存在对更广 泛的保护性流感病毒疫苗的需要。 发明概要
[0007] 本发明公开了优化的H1N1流感HA多肽的产生，该优化的H1N1流感HA多肽用于 引发针对H1N1流感病毒分离物的广泛反应性免疫应答。优化的HA多肽是基于选定的来自 1918-2012的分离的H1N1病毒，通过一系列的HA蛋白比对（alignments)，以及随后产生共 有序列而开发的。
[0008] 本发明提供了重组流感病毒HA多肽，该重组流感病毒HA多肽具有优化的氨基酸 序列，用于对H1N1流感引起广泛的反应性免疫应答。在一些实施方案中，所述HA多肽包含 氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、 SEQIDN0:5、SEQIDN0:6 或SEQIDN0:7 相比，至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、或至少99%是相同的。在一些实施方案中，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQIDNO: 1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 或SEQIDNO: 7,包括不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、或不超过10个的氨 基酸置换。在一些实施方案中，HA多肽包含SEQIDNO:8。在一些实施方案中，流感HA多 肽缺少N末端的蛋氨酸残基。
[0009] 本发明也提供了编码重组HA多肽的分离的核酸分子和载体。进一步提供了包括 这样的载体的分离的细胞。
[0010] 本发明也提供了包括本文所公开的优化的HA多肽的流感病毒样粒子（VLP)和融 合蛋白。
[0011] 本发明进一步提供了组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的本发明 所公开的优化的流感HA多肽、融合蛋白或VLP。本公开也提供通过对受试对象施用所公开 的组合物、融合蛋白或VLP而引起对流感病毒的免疫应答的方法。
[0012] 本发明也提供了通过对受试对象施用包括VLP的组合物而使受试对象对流感病 毒免疫的方法，该VLP含有优化的HA多肽。
[0013] 通过以下参考附图的详细描述，本发明上述的和其它的目标、特征和优点将变得 更加清晰。
[0014] 附图的简要说明
[0015] 图1是根据方法X-1的用于生成H1N1HA共有序列的工艺的原理图。
[0016] 图2是根据方法X-2的用于生成H1N1HA共有序列的工艺的原理图。
[0017] 图3是根据方法X-3的用于生成H1N1HA共有序列的工艺的原理图。
[0018] 图4是根据方法X-4的用于生成H1N1HA共有序列的工艺的原理图。
[0019] 图5是根据方法X-5的用于生成H1N1HA共有序列的工艺的原理图。
[0020] 图6是根据方法X-6的用于生成H1N1HA共有序列的工艺的原理图。
[0021] 图7是根据方法A-5的用于生成H1N1HA共有序列的工艺的原理图。
[0022] 图8A-8B展示了在此处阐明为SEQIDNO:1-7的H1N1HA蛋白的序列比对。
[0023] 图9A-9F的图展示了血凝抑制（HAI)血清抗体效价，该血凝抑制血清抗体效价来 自针对H1N1流感分离物的群组的经接种疫苗（0、4、12周）的小鼠。在第14周使用H1N1流 感病毒确定每个疫苗组的HAI效价。所展示是的接种VLP的小鼠的HAI效价，所述VLP包含 方法X-1HA(图9A)、方法X-2HA(图9B)、方法X-3HA(图9C)、方法X-4HA(图9D)、方法 X-5HA(图9E)、和方法X-6HA(图9F)。数值表示log2转化效价的几何平均效价（+95% 置信区间）。
[0024] 序列表
[0025] 如37C.F.R1.822中定义，通过使用标准字母缩写表示核苷酸碱基、三字母代码 表示氨基酸，而示出列于所附的序列表中的核酸和氨基酸序列。每个核酸序列只有一条链 被表示，而互补链被理解为通过任意参照所显示的链而被包括。序列表以2013年9月6日 创建的、大小42. 9KB的ASCII文本文件的形式提交。在此通过参考引入本发明。在所附序 列表中：
[0026] SEQIDN0:l-7是优化的H1N1HA蛋白的氨基酸序列，这些序列也在图8中展示。
[0027]SEQIDN0:8是优化的H1N1HA蛋白的共有氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0028] I?缩写
[0029] COBRA :计算优化的广泛反应性抗原
[0030] HA :血凝素
[0031] HAI :血凝抑制
[0032] HRP :辣根过氧化物酶
[0033] Ml :基质蛋白1
[0034] NA :神经氨酸酶
[0035] PFU :空斑形成单位
[0036] VLP :病毒样颗粒
[0037] II.术语和方法
[0038] 除非另有说明，以常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可 在以下中找到：BenjaminLewin，GenesV，OxfordUniversityPress出版，1994(ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew等（编），TheEncyclopediaofMolecularBiology，Blackwell ScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9);以及RobertA.Meyers(ed.)，Molecular BiologyandBiotechnology：aComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc. 出版，1995(ISBN1-56081-569-8)。
[0039] 为便于理解本发明的各实施方案，下面提供了对特定术语的解释：
[0040]佐剂：非特异性提高对抗原的免疫应答的物质或载体（vehicle)。佐剂可以包括 吸收抗原的矿物质（明矾、氢氧化铝、或磷酸盐）的悬浮液；或者油包水的乳剂，在所述油 包水的乳剂中，抗原溶液被乳化在矿物油中（例如：弗氏不完全佐剂），有时包含杀死的分 枝杆菌（弗氏完全佐剂）以进一步提高抗原性。免疫刺激性寡核苷酸（例如包括CpG基 序的那些）也可以作为佐剂使用（例如见美国专利号6, 194, 388 ;6, 207, 646 ;6, 214, 806 ; 6, 218, 371 ;6, 239, 116 ;6, 339, 068 ;6, 406, 705 ;和 6, 429, 199)。佐剂也包括生物分子，例如 共刺激分子。典型的生物佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-a、INF-y、G-CSF、LFA-3、 CD72、B7-2、0X-40L和 41BBL。
[0041] 施用：按本发明的用法，将组合物施用于受试对象的含义是给予、施加或带入组合 物与受试对象相接触。施用可以通过多种途径中的任一途径来完成，例如局部、口服、皮下、 肌肉、腹膜内、静脉内、鞘内和皮内。
[0042] 抗体：具有特定氨基酸序列的由B淋巴细胞所产生的免疫球蛋白分子。抗体是在 人或其它动物体内通过特定抗原（免疫原）引起的。抗体的特征在于以某种可论证的方式 特异性地与抗原的反应，抗体和抗原各自被彼此所定义。"引起抗体应答"是指抗原或其它 分子诱导抗体产生的能力。
[0043] 抗原：可以在动物体内刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物、或物质，其 中包括注射或吸收到动物体内的组合物。抗原与特异性的体液或细胞免疫的产物（包括由 异种免疫原所诱导的那些）进行反应。在所公开的组合物和方法的一些实施方案中，所述 抗原是流感HA蛋白。
[0044] 密码子优化："密码子优化"核酸是指已经改变的核酸序列，以使得这些密码子对 于在特定的系统（如物种的群体中的特定物种）中的表达是最理想的。例如，为了在哺乳 动物细胞中的表达，可以优化核酸序列。密码子的优化不改变所编码的蛋白的氨基酸序列。
[0045]融合蛋白：通过从编码两个不同（异源）蛋白的至少部分的核酸序列所设计的核 酸序列的表达所生成的蛋白。为了创造融合蛋白，核酸序列必须在相同的阅读框中并且含 有（containto)内部终止密码子。例如，融合蛋白包含融合至异种蛋白的流感HA。
[0046] 血凝素（HA):是流感病毒的表面糖蛋白。HA介导病毒粒子与宿主细胞的结合以及 随后的病毒进入宿主细胞。在该领域中许多流感HA蛋白的核苷酸和氨基酸序列都是已知 的，并且是公开可用的，例如那些存储在GenBank中的序列。HA(连同NA)是两种主要的流 感病毒抗原决定簇之一。
[0047] 免疫应答：免疫系统的细胞（如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞 (polymorphonucleocyte))对于刺激物（如抗原或疫苗）的应答。免疫应答可以包括参与 宿主防御反应的主体（body)的任何细胞，例如包括分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免 疫应答包括但不限于先天免疫应答或炎症。本发明所使用的保护性免疫应答是指保护对象 免于感染（预防感染或阻止与感染相关的疾病的发展）的免疫应答。衡量免疫应答的方法 在本领域中是已知的，例如测量淋巴细胞（如B或T细胞）的增殖和/或活性、细胞因子或 趋化因子的分泌、炎症、抗体的产生等。
[0048] 免疫原：是在适合的条件下，可以刺激免疫应答（例如在动物内的抗体的产生或T细胞的应答）的化合物、组合物或物质，免疫原包括注射或吸收到动物体内的组合物。本发 明所使用的"免疫原性组