靶向少突胶质细胞的aav载体的制作方法
【专利说明】靶向少突胶质细胞的AAV载体
[0001] 优先权声明 本申请要求于2012年9月28日提交的美国临时申请系列号61/707, 108的权益，其全 部内容通过引用结合到本文中。 发明领域
[0002] 本发明涉及靶向少突胶质细胞的嵌合AAV衣壳、包含该嵌合AAV衣壳的病毒载体 和使用所述载体以靶向少突胶质细胞的方法。
[0003] 发明背景 十几年前腺伴随病毒（AAV)被首次报道有效转导肌肉（Xiao等人，（1996)7； 70:8098-8108)。由外源表达盒和AAV反向末端重复（ITR)序列组成的重组AAV(rAAV) 基因组以附加体形式存在于真核细胞中，所述附加体形式负责持续的转基因表达（Schnepp 等人，（2003)JKirW. 77:3495-3504)。AAV载体具有良好安全特性。没有人类疾病 与野生型AAV感染有关，并且在rAAV转导后在人类受试者中观察到低毒性（Manno等人， (2003)沒101:2963-2972)。
[0004] 在脑部，大部分AAV载体对神经元表现出优势的优选，而对其它细胞类型（例如少 突胶质细胞）具有很低功效。在AAV工程改造和定向进化上的近来的进展已经扩展了开发 新的AAV血清型的能力，所述血清型包括具有改变的向性的载体（Gray等人，（2010) #〇乂 18:570-578)。然而，在中枢神经系统中，除了AAV4之外，所有AAV载体和嵌合体都 表现出优势的神经元向性。能有效靶向少突胶质细胞的AAV载体没有被开发出来。
[0005] 发明概述 本发明部分地基于对少突胶质细胞表现出优势向性的嵌合AAV衣壳序列的开发。所述 嵌合衣壳可用于产生在受试者的中枢神经系统（CNS)中转导少突胶质细胞的AAV载体。
[0006] 因此，本发明的一方面涉及编码AAV衣壳的核酸，所述核酸包含与以下序列具有 至少90%同一性的AAV衣壳编码序列：（a)SEQIDNO: 1的核苷酸序列；或（b)编码SEQID NO: 2-4的任一个的核苷酸序列；以及包含所述核酸的细胞和病毒颗粒。
[0007] 本发明的另一方面涉及包含与SEQIDN0:2-4的任一个具有至少96%同一性的氨 基酸序列的AAV衣壳，以及包含本发明的AAV载体基因组和AAV衣壳的AAV颗粒。
[0008] 本发明的另外方面涉及产生包含AAV衣壳的重组AAV颗粒的方法，所述方法包括： 在体外向细胞提供本发明的核酸、AAVrep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组、和 用于生成生产性AAV感染的辅助功能；并允许包含AAV衣壳和将AAV载体基因组壳体化的 重组AAV颗粒的装配。
[0009] 本发明的额外方面涉及药物制剂，其包含在制药上可接受的载体中的本发明的核 酸、病毒颗粒、AAV衣壳或AAV颗粒。
[0010] 本发明的另一方面涉及将目的核酸递送到少突胶质细胞的方法，所述方法包括使 少突胶质细胞接触本发明的AAV颗粒。
[0011] 本发明的另外方面涉及在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到少突胶质细胞的 方法，所述方法包括将有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂给予哺乳动物受试者。
[0012] 本发明的额外方面涉及在哺乳动物受试者中将目的核酸递送到与受累的血脑屏 障区域毗邻的CNS区域的方法，所述方法包括将有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂经 静脉内给予哺乳动物受试者。
[0013] 本发明的另一方面涉及在有需要的哺乳动物受试者中治疗少突胶质细胞功能失 调的相关病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的AAV颗粒或药物制剂给予哺 乳动物受试者。
[0014] 本发明的另外方面涉及制备具有目的向性特征的AAV衣壳的方法，所述方法包括 修饰本发明的AAV衣壳，以插入提供目的向性特征的氨基酸序列。
[0015] 本发明的这些和其它方面在以下本发明描述中更详细地阐述。
[0016] 附图简述 图1显示BNP61、BNP62、和BNP63AAV衣壳克隆的嵌合结构。
[0017] 图2A-2C显示BNP61对于大鼠尾状核（caudate)中的少突胶质细胞的向性。（A) 显示在BNP61-CBh-GFP载体输注后1周时，在大鼠尾状核中的GFP阳性的少突胶质细胞。注 意：没有GFP阳性的神经元。（B)显示反映出清晰的少突胶质细胞形态学的更高放大倍数， 和（C)显示无一GFP阳性的细胞与星形细胞的细胞标记GFAP(红色）共定位。
[0018] 图3A-3B显示在原代少突胶质细胞培养物中，BNP61对于少突胶质细胞的向性。
[0019] 图4显示在雌性野生型小鼠中在静脉内注射之后，经定量PCR确定的BNP61 (MG001)和亲代衣壳的生物分布。Y轴是每一个二倍体小鼠基因组的GFP拷贝。
[0020] 图5显示BNP61在外周给予后跨越受累的血脑屏障。
[0021] 图6显示BNP63对大鼠梨状皮质中的少突胶质细胞的向性。
[0022] 发明详述 本发明部分地基于对少突胶质细胞表现出向性的嵌合AAV衣壳序列的开发。所述嵌合 衣壳可用于产生在受试者的CNS中转导少突胶质细胞的AAV载体。
[0023] 本发明在以下被更详细地解释。该描述无意为可执行本发明的所有不同方式或可 加入本发明的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案说明的特征可并入其它实施 方案，并且关于具体实施方案说明的特征可以从该实施方案删除。另外，鉴于本公开内容， 对本文给出的各实施方案的不偏离本发明的许多改动和添加对于本领域技术人员会是显 而易见的。因此，以下说明书意在说明本发明的某些具体实施方案，而不是详尽无遗地指定 其所有排列、组合及变化。
[0024] 除非上下文另外指出，否则明确意图的是，本文所述的本发明的多个特征可以任 何组合使用。此外，本发明也考虑了在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文给出 的任何特征或特征组合。为了说明，如果说明书声明某复合物包含组分A、B和C，就明确意 图的是，A、B或C的任一个或其组合可以单独地或以任何组合来省略和放弃。
[0025] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普 通技术人员通常所理解的相同含义。本发明的描述中使用的术语仅用于描述具体实施方案 的目的，而无意限制本发明。
[0026] 除非另外明确指出，否则核苷酸序列在本文中仅通过单链以5'至3'方向从左 到右呈现。核苷酸和氨基酸在本文中以IUPAC-IUB生物化学命名委员会（Biochemical NomenclatureCommission)推荐的方式，或（对于氨基酸）通过两者均依照37C.F.R. § 1. 822和确定用法的单字母代码或三字母代码表示。
[0027] 除非另外指出，本领域技术人员已知的标准方法可以用于重组和合成多肽、抗体 或其抗原结合片段的制备，对核酸序列的操作，转化细胞的制备，对rAAV构建体、修饰的衣 壳蛋白、表达AAVrep和/或cap序列的包装载体以及瞬时转染和稳定转染的包装细胞的 构建。这些技术对于本领域技术人员而言是已知的。参见例如SAMBR00K等人，MOLE⑶LAR CLONING:ALABORATORYMANUAL(分子克隆：实验室手册）第二版?（ColdSpringHarbor, NY, 1989) ;F.M.AUSUBEL等人CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(分子生物 学的现时方法）（GreenPublishingAssociates,Inc?和JohnWiley&Sons,Inc?，纽 约）。
[0028] 本文提及的所有出版物、专利申请、专利、核苷酸序列、氨基酸序列和其它参考文 献通过引用以其整体结合。
[0029] I.宙义. 在本发明描述和所附权利要求书中在AAV衣壳亚基的所有氨基酸位置的命名都是关 于VP1衣壳亚基编号。
[0030] 除非上下文另外清楚指出，否则如本发明的描述和所附权利要求书中所用的，单 数形式"一个（a) "、"一个（an)"和"该（the)"也意在包括复数形式。
[0031] 如本文使用的"和/或"指的是且包含相关列出项的一个或多个的任何和所有可 能组合，以及在备选方案中解释时缺乏组合（"或"）。
[0032] 此外，本发明也考虑在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任 何特征或特征组合。
[0033] 此外，如本文使用的术语"大约"当提及可测量值例如本发明的化合物或剂的 量(剂量、时间、温度等）时，意在包含指定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%、或甚至 ±0. 1%的变化。
[0034] 本文中关于核酸、蛋白或衣壳结构使用的术语"基本上由……组成"意指所述核 酸、蛋白或衣壳结构不包含不同于所列举要素的显著改变（例如超过大约1%、5%或10%)所 述核酸、蛋白或衣壳结构的目的功能，例如所述蛋白或衣壳或者由所述核酸编码的蛋白或 衣壳的向性特征的任何要素。
[0035] 在本发明的上下文中的术语"腺伴随病毒"（AAV)包括但不限于AAV1型、AAV2 型、AAV3 型（包括 3A型和 3B型）、AAV4 型、AAV5 型、AAV6 型、AAV7 型、AAV8 型、AAV 9型、AAV10型、AAV11型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和羊AAV以及目前已知的或随后发 现的任何其它AAV。参见例如BERN