br>[0013] (1)将所述水稻基因0sL0L3连入表达载体中，构建得到重组表达载体；
[0014] (2)将所述重组表达载体转化受体植物。
[0015] 其中，所述受体植物为水稻或拟南芥，作为优选，所述受体植物为水稻。
[0016] 本发明还提供了一种重组表达载体，包括原始载体和插入所述原始载体的目的基 因，所述目的基因的喊基序列如SEQ ID NO. 1所不。
[0017] 重组表达载体的构建方法为常规方法。作为优选，所述重组表达载体中所述的原 始载体为 PCAMBIA1300 或 pSB326-Actin-N0S。其中，pSB326-Actin-N0S 为超表达双 T-DNA 载体，可显著提高目的基因的表达量。
[0018] 本发明还提供了一种包含所述重组表达载体的转化子。转化受体植物时，可采用 农杆菌介导转化的方法，具体地，所述的农杆菌为农杆菌EHA105。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0020] 本发明通过图拉克隆技术从水稻早衰突变体oslol3中克隆获得基因0sL0L3 ;并 通过功能互补实验证明基因0sL0L3能够延缓植物叶片衰老，通过干旱处理实验证明基因 0sL0L3在植物耐旱特性上具有明显的调节作用，能够提高植物的耐旱能力；该基因0sL0L3 可应用于植物育种领域，对耐衰老、耐旱的植物品种的筛选和选育具有重要意义。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明突变体osl〇13不同生育期的表型；
[0022] ㈧分蘖期；⑶抽穗期；
[0023] 图2为本发明突变体oslol3干旱敏感性分析结果；
[0024] (A)未干旱处理对照；(B)模拟干旱胁迫处理3周；（C)处理前两叶一心期幼苗； (D) 自然干旱9天；(E)恢复浇水13天；
[0025] 图3为本发明0sL0L3基因的定位与测序分析结果；
[0026] ㈧基因初定位；⑶基因精细定位；（C)定位区间的BAC ;⑶定位区间的ORF ; (E) 突变基因的结构及突变位点；(F)野生型位点的测序图谱；(G)突变体突变位点的测序 图谱；突变位点见箭头所示；
[0027] 图4为本发明突变体oslol3的遗传互补验证结果；
[0028] 图5为本发明超表达0sL0L3转基因拟南芥后代干旱筛选。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，在Ausubel编 写的由 John Wiley and Sons 公司出版的 Current Protocols in Molecular Biology 和 J. Sambrook等编写的由 Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning :A Laboratory MannuaUlrdED.等文献均有详细的说明。以下施例中所用的实验 材料如无特殊说明均为市售购买产品。
[0030] 实施例1突变体的分离与遗传分析
[0031] 通过6tlCo辐射诱变籼稻品种93-11，从后代中筛选出叶片早衰及干旱敏感突变体 osl〇13,经多代回交和自交获得突变性状稳定的株系。早衰性状始于osl〇13突变体植株的 分蘖期（图1A)，到抽穗开花期时，所有叶片均出现不同程度的早衰症状（图1B)。以osl 〇13 作母本，分别与9311和粳稻材料02428进行杂交获得F1, F1植株表现正常；F i自交获得的 F2后代则出现野生型和突变体表型，其分离比例野生型：突变体=3 : 1，从而说明衰老性 状受单隐性基因控制。
[0032] 实施例2突变体osl〇13的干旱敏感性分析
[0033] 在7. 5% PEG 6000模拟干旱胁迫处理3周后，突变体osl〇13叶片在苗期就早衰 (图2B)，而野生型对照93-11及未处理的突变体osl 〇13则生长正常（图2A)。与未处理的 突变体osled相比，胁迫后的突变体osl〇13株高和根长分别下降52. 1%和42. 3%;而胁迫 后的野生型对照93-11则仅比其未处理对照分别下降25. 3%和32. 9%。处理后的突变体 oslol3株高和根长也分别比处理后的野生型对照93-11下降38. 8%和18. 5%。
[0034] 野生型和突变体osl〇13两叶一心期幼苗（图2C)进行自然干旱处理9天。此时， 野生型和突变体植株叶片均严重卷缩甚至枯死（图2D)，恢复浇水13天后，野生型93-11的 存活率为77. 3% ;而突变体osl〇13的存活率仅为27. 3% (图2E)，从而进一步证实突变体 对干旱胁迫更敏感。
[0035] 实施例3衰老基因 0sL0L3的精细定位
[0036] 利用oslol3/02428的F2代群体作为定位群体，共得到137株早衰单株。选取均 匀分布于水稻12条染色体上的500对SSR引物逐条对02428和突变体oslol3进行多态性 分析，利用筛选到的多态性引物分析正常基因池和突变基因池。结果发现在水稻第3号染 色体上的SSR标记R3M30、RM15478以及RM3513在突变体基因池和正常基因池之间存在明 显的偏分离（图3A)，利用137个早衰单株验证以上标记，初步把oslol3定位在RM15478和 RM5626之间（图3A)。为进一步定位oslol3基因，在RM15528和RM15555之间设计SSR标 记，发现有4对引物在亲本之间存在多态性（表1)，利用这4对引物对&单株进行基因连 锁分析，最终将0sL0L3基因定位在RM15536与RM15553之间（图3B)，物理距离约164kb， 其间含有AC128646和AC147427等两个BAC (图3C)。根据日本晴序列，在该定位区间内有 12个注释基因（http://rapdb. dna. affrc. go. jp)(图3D)，分别为1个编码转运体蛋白、2 个编码未知表达蛋白、1个亮氨酸拉链结构蛋白、1个KxDL结构蛋白、其他分别编码锌指蛋 白、DNA修复酶、Snf7家族蛋白、Potatin蛋白、WD-40重复蛋白、类马铃薯糖蛋白和植物果 胶甲酯酶抑制蛋白。
[0037] 表1 0sL0L3基因精细定位的分子标记
[0038]
【主权项】
1. 水稻基因0sL0L3在延缓植物叶片衰老中的应用，其特征在于，所述水稻基因OsLOL3 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 水稻基因0sL0L3在提高植物耐旱性中的应用，其特征在于，所述水稻基因0sL0L3的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，包括： (1) 将所述水稻基因0sL0L3连入表达载体中，构建得到重组表达载体； (2) 将所述重组表达载体转化受体植物。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受体植物为水稻或拟南芥。
5. -种重组表达载体，包括原始载体和插入所述原始载体的目的基因，其特征在于，所 述目的基因的喊基序列如SEQ ID NO. 1所不。
6. 如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述原始载体为pCAMBIA1300或 pSB326-Actin-N0S〇
7. -种包含权利要求5或6所述重组表达载体的转化子。
8. 如权利要求7所述的转化子，其特征在于，宿主菌为农杆菌。
9. 如权利要求8所述的转化子，其特征在于，所述的农杆菌为农杆菌EHA105。
【专利摘要】本发明公开了水稻基因OsLOL3在延缓植物叶片衰老和提高植物耐旱性中的应用，所述水稻基因OsLOL3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的应用，包括：将所述水稻基因OsLOL3连入表达载体中，构建得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化受体植物。本发明通过图拉克隆技术从水稻早衰突变体oslol3中克隆获得基因OsLOL3；并通过功能互补实验证明基因OsLOL3能够延缓植物叶片衰老，通过干旱处理实验证明基因OsLOL3能够提高植物的耐旱能力；该基因OsLOL3可应用于植物育种领域，对耐衰老、耐旱植物品种的筛选和选育具有重要意义。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-29, C12N15-82, C12N1-21
【公开号】CN104805093
【申请号】CN201510157353
【发明人】潘刚, 黎坤瑜, 赵晨晨, 龚盼, 杨茜, 程方民
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月3日