重组人胰岛素的表达方法及专用表达载体、工程菌和应用
【专利说明】重组人胰岛素的表达方法及专用表达载体、工程菌和应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的是指一种重组人胰岛素的表达方法及专用表达 载体、工程菌和应用。 【【背景技术】】
[0002] 糖尿病是一种由先天或后天因素引起的胰岛素缺乏或缺少所引起的慢性疾病。这 种胰岛素的缺乏使得血糖浓度升高从而导致机体，特别是血管和神经的损伤。多饮、多尿、 多食、消瘦是糖尿病的典型症状，严重的还会出现包括酮中毒和多种脏器的慢性病变等情 况。
[0003] 糖尿病主要分为两种类型：1型和II型。I型糖尿病（Type I diabetes mellitus，TlDM)是一种自身免疫性疾病，患者的胰腺被免疫系统破坏，造成胰岛素的绝对 缺乏，多发于青少年，其治疗方法只能通过一日三次注射胰岛素来保持血糖稳定。II型糖尿 病（Type II diabetes mellitus，T2DM)，多发病于中老年，是一种胰岛素相对缺乏或胰岛 素抵抗的疾病，通常与肥胖、饮食等多种因素有关，与免疫系统无关，主要通过健康的饮食 和适当的锻炼，服用降血糖药物以及注射胰岛素来恢复和治疗。
[0004] 针对I型糖尿病，有研宄表明通过给TlDM的模型非肥胖糖尿病（Non-obese diabetic，NOD)小鼠口服胰岛素能够减轻或延缓其发病过程，其机制是抗原通过黏膜 Peyer' s区吸收，从而激活免疫系统，之后与耐受性相关的效应T细胞被激活，引发口服耐 受性，从而保护胰岛素不被损伤。但是如果直接口服抗原，因为抗原绝大多数都是蛋白质， 蛋白质在口服过程中经过胃肠环境的影响，会发生明显的降解，因此严重影响抗原的有效 作用效率。因此需要一种能够达到食品级要求的运输载体来降低或减轻抗原在经过肠胃环 境时所受的损伤。
[0005] 乳酸菌在自然界中分布广泛，且自古就被人类用于食品加工及制作，因此由于其 在食品行业的广泛而长期的应用，通常被认为是安全的食品级的生物。同时乳酸菌作为益 生菌的主要组成，具有抑制有害菌的增殖，降低胆固醇，降血压，维持生态系统平衡，抑癌和 增强免疫力等重要的生物学功能。而且已有研宄表明，将相应抗原经乳酸菌工程菌进行表 面展示，进行动物学实验可以使该动物宿主获得相应的免疫反应，如Ke-Qin Xin等人的研 宄将HIV病毒Env基因的V2-V4环（V2-V41〇〇p)通过乳酸菌表面蛋白进行表面展示，并 经过小鼠口服实验发现能够刺激小鼠产生相应的免疫反应（Ke-Qin Xin. Immunogenicity and protective efficacy of orally administered recombinant Lactococcus lactis expressing surface-bound HIV Env. BLOOD,IJULY 2003V0LUME 102, NUMBER I)〇
[0006] 为了完全符合真正意义上的食品级乳酸菌工程菌，除了宿主菌是食品级之外，其 所用到的载体也要相应达到食品级要求，即不能够具有绝大部分表达载体所使用的筛选标 记一抗性基因，因为由于抗性基因的存在，有可能对动物或人体肠道的正常菌群产生不利 影响，打乱其正常的肠道微生态系统的平衡。因此有必要利用不含抗性基因的表达载体和 乳酸菌来构建工程菌，从而符合完全食品级要求，达到能够口服利用的要求。 【
【发明内容】
】
[0007] 有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明提供一种重组人胰岛素的表达方法及 专用表达载体、工程菌和应用。
[0008] 本发明第一个目的是提供一种编码重组人胰岛素的基因，其特征在于：所述基因 为SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0009] 作为优选方案，所述专用表达载体是含有诱导型表达启动子、重组人胰岛素编码 序列、乳酸菌细胞表面蛋白编码序列的乳酸菌诱导型表面展示表达载体；其中重组人胰岛 素编码序列与乳酸菌细胞表面蛋白编码序列形成融合基因，重组人胰岛素编码序列位于乳 酸菌细胞表面蛋白编码序列的5'端，诱导型表达启动子位于所述融合基因的上游。
[0010] 进一步地，所述细胞表面蛋白为细菌表面蛋白PgsA、SPA、PrtB、PrtP、AcmA、HtrA 或 SspA0
[0011] 更进一步地，用于构建重组人胰岛素诱导型表达载体的出发载体为pMG36e、 PVE5523、pIL253、pNZ8008、pNZ8048、pNZ8148、pNZ8149、pNZ8150 或 pNZ9530 ;以 pNZ8149 为出发载体，构建的重组人胰岛素乳酸菌不含抗性基因筛选标记的诱导型表达载体为 PMRF5018。
[0012] 本发明第二个目的是提供一种表达重组人胰岛素基因的工程菌，其特征在于：是 将上述的专用表达载体转化导入乳酸菌中得到的重组菌。
[0013] 进一步地，所述乳酸菌为乳酸乳球菌L. lactisNZ3900或L. Iactis NZ3910。
[0014] 更进一步地，所述重组乳酸菌为L lactisNZ3900/pMRF5018。
[0015] 本发明第三个目的是提供一种重组人胰岛素基因的表达方法，其特征在于：是发 酵上述的工程菌，得到展示于乳酸菌表面的重组人胰岛素。
[0016] 进一步地，所述发酵携带有诱导型胞内表达载体的重组乳酸菌胞面展示重组人胰 岛素时需加入乳链菌肽Nis in，所加入Nis in的终浓度为30ng/ml，诱导温度为30°C，诱导 时间为10小时。
[0017] 本发明第四个目的是提供了种上述的工程菌在制备预防或治疗I型糖尿病口服 疫苗中的应用。
[0018] 本发明提供的重组人胰岛素编码基因序列，其为SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列， 是经过乳酸菌密码子优化且在天然人胰岛素的A、B链基因序列之间引入一段额外基因序 列，该基因序列经过转录、翻译成的连接肽能够形成β折叠，从而使本发明提供的重组人 胰岛素具有与天然胰岛素非常相似的结构。
[0019] 本发明所提供的用于表达重组人胰岛素的表达载体，是含有诱导型表达启动子， 重组人胰岛素编码序列和乳酸菌细胞表面蛋白编码序列的乳酸菌诱导表面展示表达载体。 其中重组人胰岛素编码序列与乳酸菌细胞表面蛋白编码序列形成融合基因，重组人胰岛素 编码序列位于乳酸菌细胞表面蛋白编码序列的5'端，诱导型表达启动子位于所述融合基因 的上游。
[0020] 所述乳酸菌诱导型胞内表达载体中细菌细胞表面蛋白的可选择范围非常广 泛，比如细菌表面蛋白 PgsA (GenBank 号：KJ175232. I)、SPA (GenBank 号：KJ794101. 1)、 PrtB (GenBank 号：L48487. 2)、PrtP (GenBank 号：FM883700.1 )、AcmA(GenBank 号： U17696. I)、HtrA (GenBank 号：AJ005672. I)、SspA (GenBank 号：JNl 12240. 1)等。
[0021] 用于构建重组人胰岛素表达的乳酸菌诱导型表达载体的出发载体具有广泛的选 择范围，比如常见的有口犯8008邛犯8048邛犯8148邛犯8149邛犯8150或口犯9530等。
[0022] 以pNZ8149为出发载体构建的含有所述的重组人胰岛素编码序列及乳酸乳球菌 自溶素 AcmA编码序列的乳酸菌诱导型胞内表达载体为pMRF5018。
[0023] 上述表达载体可按照基因工程领域的常规方法进行构建。
[0024] 本发明的优点在于：本发明所构建的用于表达重组人胰岛素的表达载体，是含有 诱导型表达启动子，重组人胰岛素编码序列和乳酸菌细胞表面蛋白编码序列的乳酸菌诱导 胞内表达载体。将所构建成功的重组人胰岛素专用表达载体导入相应乳酸菌，即可得到重 组人胰岛素表达的专用乳酸菌工程菌。培养和发酵该乳酸菌工程菌即可实现重组人胰岛素 在乳酸菌表面展示表达。实验证明，本发明的重组人胰岛素专用表达工程菌能够正确的在 其表面对重组人胰岛素进行展示表达，定位于乳酸菌工程菌表面的重组人胰岛素具有与天 然胰岛素十分相似的空间结构，其可以与胰岛素多克隆抗体发生特异性结合。
[0025] 通过对TlDM的模型非肥胖糖尿病（Non-obese diabetic，NOD)小鼠口服实验证 明，本发明构建的乳酸菌工程菌能够在肠道内存活48小时以上，同时可以刺激NOD小鼠免 疫系统产生重组人胰岛素特异性抗体，使与免疫耐受相关的细胞因子IL-4水平显著上升， 诱导免疫耐受产生。实验结果表明，本发明的能够表面展示重组人胰岛素的乳酸菌工程菌 能够有效的治疗或预防I型糖尿病。
[0026] 本发明利用的表达载体，宿主工程菌，诱导剂Nisin等完全符合食品级要求，其中 最主要的一点是表达载体是非抗性基因携带型质粒，口服之后不存在因抗性基因存在而产 生的对人体肠道菌群微生态系统的破坏等潜在风险。只需将诱导后的乳酸菌工程菌制成菌 剂即可作为I型糖尿病的口服疫苗，不需要纯化等繁琐的后加工过程，具有广泛的应用前 景。 【【附图说明】】
[0027] 图1为本发明人胰岛素基因⑴与重组人胰岛素基因（2)序列比对分析。
[0028] 图2为本发明重组人胰岛素诱导型表面展示表达载体的pMRF5018构建过程的示 意图。
[0029] 图3为本发明工程菌L. lactisNZ3900/pMRF5018及相应阴性对照诱导表达后提取 蛋白进行western blot实验检测结果图。
[0030] 图4为本发明工程菌L. lactisNZ3900/pMRF5018及相应阴性对照诱导表达后对菌 体进行荧光显微镜下拍照结果图。
[0031] 图5为本发明取工程菌L. lactisNZ3900/pMRF5018诱导前后的细胞进行流式细胞 仪分析结果图。
[0032] 图6为本发明不同处理组NOD小鼠血清中重组人胰岛素特异性抗体检测分析图。
[0033] 图7为本发明不同处理组NOD小鼠血清中IL-4水平检测结果。 【【具体实施方式】】
[0034] 为了更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对本发明进行详细的说明。 下述实施例中所用方法如无特别说明均为