用于下一代测序靶富集的快速杂交的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于快速核酸杂交的组合物和方法。具体地，其涉及在下一代测序中 用于靶核酸富集和选择的杂交组合物和方法。
【背景技术】
[0002] 核酸测序是分子生物学中一种最为广泛使用的工具。利用自动DNA测序仪发展快 速灵敏的测序方法使现代分子生物学发生彻底变革。具体的，采用下一代测序技术对植物、 病毒、细菌、真菌和动物的全基因组进行分析已成为可能。
[0003] 下一代测序技术为基因组测序过程带来更高水平的效率。然而，虽然技术取得进 步，全基因组测序仍伴随巨大的开销和工作量，这是由于相关的工作流程往往比较复杂、旷 日持久且实施成本很高。此外，关于精确的样品制备、扩增和测序存在多种技术缺陷。因此， 在短时间内对基因组快速测序的目标尚未实现。
[0004] 下一代测序的实施与某些类型基因组DNA测序子（sequencer)(例如，外显子）革巴 富集的相关性使得技术人员将目光聚焦在那些靶上。利用这种靶向的下一代测序的变化， 仅对感兴趣的基因组区域进行测序，其减少了成本并使每次研宄能够分析更多样品从而令 流程高效。降低测试的DNA量使得研宄者有可能在实施实验中采用统计学上更相关的样品 数目。
[0005] 本领域已有多种用于靶富集的手段。最普遍使用的技术基于杂交捕获、PCR以 及分子倒置探针。对于大的靶区域，杂交捕获效率最高。该方法的主要优势在于溶液中 富集而非在微阵列上富集，其简化了操作并使所需D NA变少。溶液中捕获，如A g i I e n t Technologies, Inc.的 SureSelect Target Enrichment System?，经常利用由 DNA 模板寡 核苷酸文库转录而来的生物素化的RNA诱饵分子，这些分子是关键成分，同时也是成本的 主要部分。见US 20100029498，Mertes et al.、Brief Funct Genomics 10:374_386、Gnirke et al·，Nat. Biotechnol. 27:182-189 以及 Albert et al·，Nat. Methods 4:903-905。
[0006] 然而，靶向的下一代测序技术非常耗费时间。对于靶向的下一代测序技术的成功 实施而言，主要的瓶颈和速度限制步骤是在前端步骤中以快速和节约成本的方式选择性地 捕获和富集散布在基因组、线粒体和其他形式的DNA中的靶外显子或内含子区域。事实上， 目前选择性的杂交捕获过程通常需要16小时至超过70小时。见，例如US 20100029498和 Agilent Technologies, Inc 的 SureSelect Target Enrichment System?。因此，通常需要 2-4天来生成一个准备用于测序的样品并需要更长时间来完成整个测序过程。
[0007] 因此，用于下一代测序的快速靶富集或核酸选择的组合物和方法存在需求。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及用于核酸杂交的新型组合物、相关试剂盒以及相关的方法。这些组合 物和方法与传统过程相比，使得技术人员能够快得多地完成预期的基因组DNA测序子的靶 富集。
[0009] -方面，本发明的特征为一种用于核酸杂交的组合物（即，杂交组合物）。所述组 合物包含浓度为约IOOmM至约600mM的二价阳离子盐（例如，约150-500mM、200-400mM、 250-350mM、100mM、120mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM 和 600mM)以及缓冲剂。所述的盐和缓冲剂在组合物中的摩尔比为约2. 5:1至约60:1 (例如， 2.5:1 至 30:1、2·5:1 至 20:1、2· 5:1 至 15:1、10:1 至 20:1、2· 5:1 至 5:1、2· 5:1、5:1、8:1、 10:1、12:1、15:1和20:1)。在组合物中，缓冲剂可以具有约IOmM至约40mM的浓度（例如， 15-35mM、20-30mM、20-40mM、20mM、25mM、30mM、35mM 和 40mM)。
[0010] 所述二价阳离子可选自：镁离子、钙离子、锰离子、钴离子、锌离子和镉离子。在一 个实施方案中，所述二价阳离子是镁离子。
[0011] 缓冲剂可选自：Tris、HEPES、TAPS、N-三（羟甲基）甲基甘氨酸（Tricine)、N，N-二 (2-羟乙基）甘氨酸（Bicine)、Bis-Tris、NaOH、KOH、TES、EPPS 和 MOPS。组合物的 pH值可以 为约 7. 0-11. 0,例如，7. 5-10. 0、7· 0-9. 0、7· 0、7· 5、8· 0、8· 5、9· 0、9· 5、10· 0、10· 5 和 11. 0。
[0012] 在优选的实施方案中，所述组合物还进一步包括体积-排除 (volume-exclusion)/增稠作用剂。该体积-排除/增稠作用剂的浓度可以为约0. 002% 至约15% w/w。所述作用剂可选自：羟丙基甲基纤维素（HPMC)、羟乙基甲基纤维素（HEMC)、 羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羟基甲基纤维素。在这种情况下，所述 作用剂的浓度可以为约〇. 002%至约0. 1% w/w(例如，约0. 002%至约0. 050%、0. 004% 至 0.020%、约 0.006%至0.012%以及约 0.006%、0.007%、0.008%、0.009%、0.010%、 0. 012%、0. 015%和0. 020% )。所述体积-排除/增稠作用剂也可选自葡聚糖和聚乙二醇 (PEG)。并且在这种情况下，该作用剂的浓度可以为约1 %至约15% w/w。
[0013] 杂交组合物还可以进一步包括一种或多种额外的作用剂，选自：RNA酶抑制剂、 阻断剂、诱饵核酸和靶核酸。在一些实施方案中，所述靶核酸的浓度可以为在30-μ1反 应中约 250-3000ng(例如，500-2000ng，和 750-1500ng)，例如，8. 3 至 IOOng/ μ 1 (例如， 16. 7-66. 7ng/ μ 1和25-50ng/ μ 1)。优选地，所述体积-排除/增稠作用剂和核酸以约0. 2 至 120(例如，(λ 2-100、0· 2-50、0· 5-10 和 0· 8-8. 0)的比例存在。
[0014] 在杂交组合物的一个实施方案中，所述盐是MgCl2，所述体积-排除/增稠作用剂 是HPMC且所述缓冲剂是Tris，ρΗ8. 0。优选地，所述盐具有约308mM的浓度，HPMC具有约 0. 00834%的浓度；且缓冲剂具有约20mM的浓度。所述盐和作用剂在组合物中的摩尔比为 约15.4:1。所述组合物可无单价阳离子或其盐。
[0015] 上述缓冲组合物可以由浓缩的储液制备以便容纳其他试剂包括靶、探针、诱饵、阻 断剂、润湿剂以及杂交增强因子的加入，这是核酸杂交反应领域的通常做法。相应地，本发 明还提供用于制备上述的杂交组合物的缓冲浓缩液。该缓冲浓缩液可以为2-20X(例如， 3-15乂、4-1(^、2乂、3乂、4乂、5乂、1(^、15乂和2(^)的储液以便通过稀释系数为约2倍至20倍（例 如，3-15倍、4-10倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍和20倍）的稀释获得上述的杂交组 合物。在优选的实施方案中，缓冲浓缩液是5X储液且通过稀释系数为5倍的稀释获得上述 杂交组合物。
[0016] 本发明还提供了包含上述缓冲浓缩液或杂交组合物及其适合的包装材料的试剂 盒。
[0017] 按照本文公开，所述杂交组合物可被用于靶核酸和诱饵核酸的核酸杂交。相应地， 本发明还提供了用于靶核酸和诱饵核酸的核酸杂交的方法。举例而言，所述方法包括下列 步骤：使上述组合物接触靶核酸和诱饵核酸来形成杂交混合物；在第一温度使杂交混合 物变性第一时间段（例如，在95°C持续2-30分钟，如2、5、1