60210997中找到，其内容作为参考文献并入本文。这 些缓冲液或化合物通常且有利地为生物学惰性并不干扰生化反应。
[0047] 附加组分
[0048] 根据本发明的缓冲组合物可被用于多个核酸杂交反应方案。实例包括溶液杂交、 基于支持物的杂交、例如，膜上的Northern、Southern和原位杂交，微阵列以及细胞/组织 玻片。相应地，反应时间和温度、热循环方案、杂交探针/诱饵序列和浓度、用于这些方案的 检测剂（例如，染料、酶、放射性同位素以及荧光团）一般可不加改变地与本发明的缓冲组 合物一起使用。因此，如下文讨论的本发明的缓冲组合物或相关浓缩物形式可包括一种或 多种适用于所述方案的附加组分。
[0049] 这些附加组分的实例包括核苷酸、核酸聚合酶、引物、核酸模板、染料、杂交诱饵/ 探针、杂交增强因子、封闭剂/封闭物（如载剂核酸或蛋白质）、去污剂（例如，NP40)、表面 活性剂、湿润剂和核酸酶抑制剂（例如，RNA酶抑制剂）。
[0050] 2.缓冲浓缩物
[0051] 本发明的缓冲组合物可制备成浓缩储液以便容纳其他试剂包括靶、探针、诱饵、阻 断剂、润湿剂和杂交增强因子的加入，这是核酸杂交反应领域的通常做法。缓冲组合物可以 制备成浓缩物，其中所有组分与期望的最终浓度相比，为2倍至20倍的较高浓度，例如5倍 高或10倍高的浓度。
[0052] 本发明缓冲浓缩液的实例包括5X储液，其包含1540mM MgCl2. 6H20、0. 0417% HPMC 和 IOOmM Tris(pH 8)。另一实例是 2X 储液，其包含 616mM MgCl2. 6Η20、0· 01668% HPMC 以 及 40mM Tris(pH 8)。另一实例是 4Χ 储液，其包含 1232mM MgCl2. 6H20、0. 03336%HPMC、以 及 80mM Tris(pH 8)。
[0053] 3.杂交方法
[0054] 另一方面，本公开提供了使一组核酸探针或诱饵与靶核酸群杂交的方法。该杂交 方法包括如下步骤：使核酸与本发明的杂交缓冲组合物接触或组合；以及在两个杂交温度 下温育所得到的混合物，这两个杂交温度可以不同或相同。
[0055] 当两个温度不同时，两个温度间的差别应该大到（例如，5-40°C、20-35°C、20°C、 25°C、30°C和35°C )足够导致混合物中组分（例如，探针/诱饵和靶核酸）产生对流运动。 在这种情况下，较高的温度可以为约55°C至约75°C (例如，60-70°C和65°C )且较低的温度 可以为约30°C至约50°C (例如，35-45°C和37°C )。
[0056] 按以上所述，温育/杂交的时间段可例如为约25分钟至超过8小时。该方法在速 度和省时至关重要时特别令人满意。优选地，缓冲剂可选自一种或多种上文公开的缓冲剂， 如在pH6和11的pH范围内具有缓冲能力的Tris。阳离子可以通过盐来提供，优选地选自 一种或多种上文公开的盐及其组合。更优选地，杂交缓冲组合物可进一步包含一种或多种 附加试剂，如体积-排除/增稠剂、RNA酶抑制剂、封闭剂和表面活性剂。
[0057] 本发明的杂交方法可用于多种形式的核酸杂交，如溶液杂交以及在固体支持物上 的杂交（例如，膜上的NortherruSouthern和原位杂交、微阵列以及细胞/组织玻片）。特 别是，本方法适用于在靶向的下一代测序中使用的用于某些类型的基因组DNA序列（例如， 外显子）的靶富集的溶液杂交捕获。如以上所述，靶核酸的选择性捕获和富集已成为主要 瓶颈和限速步骤，且常规的杂交方法不能提供令人满意的快速方法。本发明的杂交方法可 与 Agilent Technologies, Inc. , Illumina, Inc. , 454Life Sciences, Life Technologies Corporation, Affymetrix, Inc.提供的系统和平台及其他联合用于革El向的下一代测序。
[0058] 变性和封闭步骤可按本领域已知的标准、常规方法实施，但热循环杂交温育步骤 是独特的。当用于本发明的杂交缓冲液时，杂交时间可减少至仅约25分钟。
[0059] 本发明的方法和组合物使得技术人员可以通过，举例而言，缩短杂交流程，从而加 快选择性捕获和靶核酸富集来克服本领域的问题。按照本文公开，本发明的方法和组合物 几乎没有偏倚，并表现出良好的特异性、读数分布、序列覆盖范围以及用于下一代测序应用 的可重复性。所述方法的一个实例包括如下步骤：
[0060] 步骤1 :在室温预温本发明的快速杂交缓冲液直至解冻并在室温保持直至准备好 供使用。
[0061] 步骤2 :在室温设置封闭反应。向每12yL制备好的DNA样品（750-1500ng总 DNA)中加入5 μ L封闭混合物。上下吹打混合。短暂离心。如果12 μ L样品中的DNA超过 1500ng，则使用更小的样品体积，并加入水至总体积为17 μ L的封闭反应。
[0062] 步骤3 :如下表所示设置SureCycler 8800热循环仪程序。开始程序并立即点击暂 停（pause)按钮。这样做会在加热盖子的同时将封闭混合物加入至预先制备的基因组DNA 片段文库中。
[0063] 步骤4 :点击开始（play)按钮恢复运行程序来在SureCycler 8800上实施加热程 序。
[0064] 循环程序：封闭和快速杂交温育
[0065]
【主权项】
1. 用于核酸杂交的组合物，其包含浓度为约IOOmM至约600mM的二价阳离子盐、以及缓 冲剂，其中所述盐和所述缓冲剂以约2. 5:1至约60:1的摩尔比存在。
2. 权利要求1所述的组合物，其还包含浓度为约0. 002%至约15% w/w的体积-排除 /增稠作用剂。
3. 权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂具有约IOmM至约40mM的浓 度。
4. 权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述二价阳离子选自：镁离子、钙离子、 锰离子、钴离子、锌离子和镉离子。
5. 权利要求2-4中任一项所述的组合物，其中所述体积-排除/增稠作用剂选自：羟 丙基甲基纤维素（HPMC)、羟乙基甲基纤维素（HEMC)、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲 基纤维素和羟基甲基纤维素。
6. 权利要求2-5中任一项所述的组合物，其中所述体积-排除/增稠作用剂选自：葡 聚糖和聚乙二醇（PEG)。
7. 权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述缓冲剂选自：Tris、HEPES、TAPS、 N-三（羟甲基）甲基甘氨酸、N，N-二（2-羟乙基）甘氨酸、Bis-Tris、NaOH、KOH、TES、EPPS 和 MOPS。
8. 用于制备杂交溶液的缓冲浓缩物，其通过2倍至20倍范围的稀释产生权利要求1-7 中任一项所述的组合物。
9. 用于核酸杂交的试剂盒，其包含权利要求1-8中任何一项所述的组合物或缓冲浓缩 物及其包装材料。
10. 用于靶核酸与诱饵核酸的核酸杂交的方法，其包括： 用权利要求1-7中任一项所述的组合物接触靶核酸和诱饵核酸来形成杂交混合物； 在第一温度使所述杂交组合物变性第一时段； 在第二温度封闭所述混合物第二时段； (i)在第三温度温育所述混合物第三时段进而（ii)在第四温度温育所述混合物第四 时段，及 重复所述温育步骤一次或多次。
【专利摘要】本发明涉及靶富集或利用杂交选择核酸的组合物和方法，其可被用于例如下一代测序。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104805180
【申请号】CN201510037254
【发明人】M·伯恩斯
【申请人】安捷伦科技有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年1月23日
【公告号】EP2902504A1, US20150211047