灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种灵芝三萜酸发酵提取工艺方法，具体涉及一种能有效提高产量的 灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，属于生物发酵技术领域。
【背景技术】
[0002] 灵芝三萜酸属于灵芝的二级代谢物，是灵芝中除多糖外的另一种关键性药效成 分，具有止痛、镇静抑制组胺释放、解毒、保肝、毒杀肿瘤细胞、提高机体免疫力、降血糖等作 用。
[0003] 现有技术中灵芝三萜酸的发酵提取水平不高，产量偏低限制了其工业化生产的发 展，不能满足现代工业化发酵生产的需要。
[0004] 在申请号00111953. 2的中国专利中提出了液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝 三萜酸的技术。该技术的缺点是灵芝三萜的发酵周期太长，液体好氧发酵加上静置培养的 总发酵时间长达2-3周，生产周期过长，因此，其整体生产效率较低。
[0005] 目前，现有技术中采用的有机溶剂法通常需要较长的提取时间并消耗大量的提取 溶剂，同时大量有机溶剂的使用会给人体和环境带来不利的影响。另外由于灵芝子实体由 纤维素、半纤维素和木质素等主要成分构成，结构紧密，传统的浸提法时间长、耗能高，活性 成分提取物得率低。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，本发明所提供的 灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法能有效解决现有技术中灵芝子实体栽培资源浪费，三萜 酸培养提取时间长，有效提取率和纯度不高，不易进行大规模工业化生产的问题。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] -种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，所述灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法 包括如下步骤：
[0009] (1)配置培养基：所述培养基主要由以下组分配制而成（w/ν):葡萄糖 25. 0-27. Og/L，玉米粉 10. 2-12. 2g/L，麸皮粉 9. 8-11. 8g/L 和蛋白胨 4. 9-6. 9g/L ;
[0010] (2)发酵培养：在培养基中添加400-500mg/L的桔梗水提物或180-220mg/L的金 银花和枸杞醇提物，之后接入灵芝种子培养物进行发酵培养，发酵培养条件如下：发酵起始 pH值为5. 5-6. 5,温度为28-32°C，摇床转速为150-170r/min，发酵时间为166-170h ;发酵 过程结束后将得到的灵芝发酵菌体烘干至恒重；所述灵芝种子培养物为灵芝菌丝体或灵芝 子实体；
[0011] ⑶提取分离：包括以下步骤：
[0012] ①将干燥至恒重的灵芝发酵菌体粉碎后萃取三至四次，所述萃取方法为：先将灵 芝发酵菌体的粉碎物与氯仿提取液按0. 8-1. 2:14 (W:V)比例混合，接着将该混合液与浓度 为4.8-5.2%(1:￥)的似!10)3溶液按照2.8-3.2 :1(￥:￥)比例混合，浸泡22-2611后，提取萃 取液，将剩余物质按照本方法进行下一次萃取；之后将几次萃取获得的萃取液合并，利用超 声辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min， 停滞8-12min，再次超声处理28-32min ;然后过滤分离；
[0013] ②过滤分离后得到滤液α和滤渣；先将滤渣按〇. 8-1. 2:8 (W:V)比例加入浓度 为4. 8-5. 2 % (W: V) NaHCO3溶液，利用超声辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用 50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min，停滞8-12min，再次超声处理28-32min，之后利 用孔径为0.4-0. 5 μπι的微孔滤膜过滤得到滤液β ;接着将滤液α和滤液β合并，开启分 散机，调整转速至4800-5200r/min，分散18-22min，得上清液；之后在3. 8-4. 2°C冰浴条件 下，将上清液用5. 8-6. 2mol/L的稀盐酸进行酸化至pH = 2. 8-3. 2,得到酸化液；
[0014] ③将酸化液用等体积的氯仿提取液萃取3-5次后，收集并合并萃取液，将萃取液 静置35-45min，用孔径0. 4-0. 5 μ m的微孔滤膜过滤，得到黄色清液；
[0015] ④将黄色清液在44-46?条件下减压蒸干得到黄色粘稠液体，将黄色粘稠液体在 58-62°C水浴条件下干燥烘干至恒重；
[0016] 步骤①和步骤③所述的氯仿提取液是由氯仿和无水乙醇按照95:5-98:2的体积 配比配制而成。
[0017] 进一步的，所述桔梗水提物的提取工艺如下：取桔梗90-110g，用水煎制煮沸 25-35min，倒出药渣，补加适量冷水于药渣中，再煮沸18-22min，倒出药汁，之后再补加适量 冷水于药渣中，煮沸18-22min，倒出药汁，合并药汁，过滤药汁，将过滤后的药汁于55-65°C 下干燥，得到桔梗水提物。
[0018] 所述金银花和枸杞醇提物的提取工艺如下：将金银花和枸杞按照0. 8-1. 2 :1的质 量配比混合后，30-50目粉碎，之后用纱布包好扎紧，放入酒精回流提取仪中，用2. 5-3. 5倍 的乙醇提取2. 5-3. 5h，获得萃取液，将剩余物质再加入2. 5-3. 5倍的乙醇提取I. 5-2. 5h，再 次获得萃取液，之后合并两次获得的萃取液，旋蒸减压浓缩得到金银花和枸杞醇提稠状物； 所述乙醇的体积百分浓度为93-97%。
[0019] 更进一步的，步骤（3)的第③步中所述的萃取液在静置前先加入纤维素复合酶 进行酶解，酶解温度45-55°C，pH = 5. 5-6. 5,酶解时间18-22min，纤维素复合酶的加入量 为萃取液的1.5-2. 5% (W:V);所述纤维素复合酶由纤维素酶、蛋白酶、果胶酶按比活力 4. 8-5. 2:2. 8-3. 2:1. 8-2. 2 混合而成。
[0020] 本发明所提供的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法对比现有技术有如下优点：
[0021] 1)菌种的培养周期短；
[0022] 2)原材料易得，生产成本低；
[0023] 3)节能降耗；
[0024] 4)提高灵芝三萜酸的生产效率和提取得率，所得的灵芝三萜酸质量稳定；
[0025] 5)产量稳定，不受季节和原材料的影响；
[0026] 6)适合大规模工业化生产。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合【具体实施方式】和具体实施例来对本发明进行详细的说明。
[0028] (一）【具体实施方式】如下：
[0029] -种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，所述灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法 包括如下步骤：
[0030] (1)配置培养基：所述培养基主要由以下组分配制而成（w/ν):葡萄糖 25. 0-27. Og/L，玉米粉 10. 2-12. 2g/L，麸皮粉 9. 8-11. 8g/L 和蛋白胨 4. 9-6. 9g/L ;
[0031] (2)发酵培养：在培养基中添加400-500mg/L的桔梗水提物或180-220mg/L的金 银花和枸杞醇提物，之后接入灵芝种子培养物进行发酵培养，发酵培养条件如下：发酵起始 pH值为5. 5-6. 5,温度为28-32°C，摇床转速为150-170r/min，发酵时间为166-170h ;发酵 过程结束后将得到的灵芝发酵菌体烘干至恒重；所述灵芝种子培养物为灵芝菌丝体或灵芝 子实体；
[0032] (3)提取分离：包括以下步骤：
[0033] ①将干燥至恒重的灵芝发酵菌体粉碎后萃取三至四次，所述萃取方法为：先将灵 芝发酵菌体的粉碎物与氯仿提取液按〇. 8-1. 2:14 (W:V)比例混合，接着将该混合液与浓度 为4.8-5.2%(1:￥)的似!10)3溶液按照2.8-3.2 :1(￥:￥)比例混合，浸泡22-2611后，提取萃 取液，将剩余物质按照本方法进行下一次萃取；之后将几次萃取获得的萃取液合并，利用超 声辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min， 停滞8-12min，再次超声处理28-32min ;然后过滤分离；
[0034] ②过滤分离后得到滤液α和滤渣；先将滤渣按〇. 8-1. 2:8(W:V)比例加入浓度 为4. 8-5. 2 % (W: V) NaHCO3溶液，利用超声辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用 50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min，停滞8-12min，再次超声处理28-32min，之后利 用孔径为0.4-0. 5 μπι的微孔滤膜过滤得到滤液β ;接着将滤液α和滤液β合并，开启分 散机，调整转速至4800-5200r/min，分散18-22min，得上清液；之后在3. 8-4. 2°C冰浴条件 下，将上清液用5. 8-6. 2mol/L的稀盐酸进行酸化至pH = 2. 8-3. 2,得到酸化液；
[0035] ③将酸化液用等体积的氯仿提取液萃取3-5次后，收集并合并萃取液，将萃取液 静置35-45min，用孔径0. 4-0. 5 μ m的微孔滤膜过滤，得到黄色清液；
[0036] ④将黄色清液在44-46?条件下减压蒸干得到黄色粘稠液体，将黄色粘稠液体在 58-62°C水浴条件下干燥烘干至恒重；
[0037] 步骤①和步骤③所述的氯仿提取液是由氯仿和无水乙醇按照95:5-98:2的体积 配比配制而成。
[0038] 步骤（3)的第③步中所述的萃取液在静置前可先加入纤维素复合酶进行酶 解，酶解温度45-55 °C，pH = 5. 5-6