程结束后将得到的灵芝发酵菌体烘干至恒重；所述灵芝种子培养物为灵芝菌 丝体或灵芝子实体；
[0081] 所述桔梗水提物的提取工艺如下：取桔梗110g，用水煎制煮沸35min，倒出药澄， 补加适量冷水于药渣中，再煮沸22min，倒出药汁，之后再补加适量冷水于药渣中，煮沸 22min，倒出药汁，合并药汁，过滤药汁，将过滤后的药汁于65°C下干燥，得到桔梗水提物；
[0082] (3)提取分离：包括以下步骤：
[0083] ①将干燥至恒重的灵芝发酵菌体粉碎后萃取三至四次，所述萃取方法为：先将灵 芝发酵菌体的粉碎物与氯仿提取液按I. 2:14(W:V)比例混合，接着将该混合液与浓度为 5. 2% (W:V)的NaHCCV^液按照3.2:1 (V:V)比例混合，浸泡26h后，提取萃取液，将剩余物 质按照本方法进行下一次萃取；之后将几次萃取获得的萃取液合并，利用超声辅助设备，在 420W超声输出功率下，采用60kHz的超声频率，超声处理32min，停滞12min，再次超声处理 32min ;然后过滤分离；
[0084] ②过滤分离后得到滤液α和滤渣；先将滤渣按I. 2:8(W:V)比例加入浓度为 5.2%(1:￥)似!1〇)3溶液，利用超声辅助设备，在4201超声输出功率下，采用60沾^的超声 频率，超声处理32min，停滞12min，再次超声处理32min，之后利用孔径为0. 5 μ m的微孔滤 膜过滤得到滤液β ;接着将滤液α和滤液β合并，开启分散机，调整转速至5200r/min，分 散22min，得上清液；之后在4. 2°C冰浴条件下，将上清液用6. 2mol/L的稀盐酸进行酸化至 pH = 3. 2,得到酸化液；
[0085] ③将酸化液用等体积的氯仿提取液萃取5次后，收集并合并萃取液，将萃取液静 置45min，用孔径0. 5 μ m的微孔滤膜过滤，得到黄色清液；
[0086] ④将黄色清液在46°C条件下减压蒸干得到黄色粘稠液体，将黄色粘稠液体在 62°C水浴条件下干燥烘干至恒重；
[0087] 步骤①和步骤③所述的氯仿提取液是由氯仿和无水乙醇按照49:1的体积配比配 制而成。
[0088] 实施例3-2
[0089] 实施例1-2与实施例1-1区别在于：将培养基中添加的桔梗水提物替换为220mg/ L的金银花和枸杞醇提物。
[0090] 所述金银花和枸杞醇提物的提取工艺如下：将金银花和枸杞按照1. 2 :1的质量配 比混合后，50目粉碎，之后用纱布包好扎紧，放入酒精回流提取仪中，用3. 5倍的乙醇提取 3. 5h，获得萃取液，将剩余物质再加入3. 5倍的乙醇提取2. 5h，再次获得萃取液，之后合并 两次获得的萃取液，旋蒸减压浓缩得到金银花和枸杞醇提稠状物；所述乙醇的体积百分浓 度为97%。
[0091] 实施例3-3
[0092] 实施例1-3与实施例1-1区别在于：步骤（3)的第③步中所述的萃取液在静置前 可先加入纤维素复合酶进行酶解，酶解温度55°C，pH = 6. 5,酶解时间22min，纤维素复合酶 的加入量为萃取液的2.5% (W:V);所述纤维素复合酶由纤维素酶、蛋白酶、果胶酶按比活 力5. 2:3. 2:2. 2混合而成。
[0093] 在以上各实施例中：
[0094] 经过对各实施例的测试，该灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法各项技术指标如下 各表所示：
[0095] 表1为本发明所提供的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法的各实施例接种前培 养基的总糖量、总氮浓度及碳氮比和发酵结束时培养基的残糖量和残氮浓度的实验数据：
[0096]
【主权项】
1. 一种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于：所述灵芝三萜酸深层发酵提 取工艺方法包括如下步骤： (1) 配置培养基：所述培养基主要由以下组分配制而成（W/V):葡萄糖25. 0-27. Og/L， 玉米粉 10. 2-12. 2g/L，麸皮粉 9. 8-1L 8g/L 和蛋白胨 4. 9-6. 9g/L ; (2) 发酵培养：在培养基中添加400-500mg/L的桔梗水提物或180-220mg/L的金银花 和枸杞醇提物，之后接入灵芝种子培养物进行发酵培养，发酵培养条件如下：发酵起始PH 值为5. 5-6. 5,温度为28-32°C，摇床转速为150-170r/min，发酵时间为166-170h ;发酵过程 结束后将得到的灵芝发酵菌体烘干至恒重；所述灵芝种子培养物为灵芝菌丝体或灵芝子实 体； (3) 提取分离：包括以下步骤： ① 将干燥至恒重的灵芝发酵菌体粉碎后萃取三至四次，所述萃取方法为：先将灵芝发 酵菌体的粉碎物与氯仿提取液按0. 8-1. 2:14(W:V)比例混合，接着将该混合液与浓度为 4. 8-5. 2% (W:V)的NaHCCV^液按照2. 8-3. 2:1(V:V)比例混合，浸泡22-26h后，提取萃取 液，将剩余物质按照本方法进行下一次萃取；之后将几次萃取获得的萃取液合并，利用超声 辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min，停 滞8-12min，再次超声处理28-32min ;然后过滤分离； ② 过滤分离后得到滤液a和滤渣；先将滤渣按0.8-1. 2:8(W:V)比例加入浓度为 4. 8-5. 2 % (W: V) NaHCO3溶液，利用超声辅助设备，在380-420W超声输出功率下，采用 50-60kHz的超声频率，超声处理28-32min，停滞8-12min，再次超声处理28-32min，之后利 用孔径为0.4-0. 5 ym的微孔滤膜过滤得到滤液0 ;接着将滤液a和滤液0合并，开启分 散机，调整转速至4800-5200r/min，分散18-22min，得上清液；之后在3. 8-4. 2°C冰浴条件 下，将上清液用5. 8-6. 2mol/L的稀盐酸进行酸化至pH = 2. 8-3. 2,得到酸化液； ③ 将酸化液用等体积的氯仿提取液萃取3-5次后，收集并合并萃取液，将萃取液静置 35-45min，用孔径0. 4-0. 5 y m的微孔滤膜过滤，得到黄色清液； ④ 将黄色清液在44-46 °C条件下减压蒸干得到黄色粘稠液体，将黄色粘稠液体在 58-62°C水浴条件下干燥烘干至恒重； 步骤①和步骤③所述的氯仿提取液是由氯仿和无水乙醇按照95:5-98:2的体积配比 配制而成。
2. 根据权利要求1所述的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于： 步骤（1)所述培养基主要由以下组分配制而成（W/V):葡萄糖26. Og/L，玉米粉11. 2g/ L，麸皮粉10. 8g/L和蛋白胨5. 9g/L。
3. 根据权利要求2所述的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于： 步骤（2)所述的培养基中添加450mg/L桔梗水提物或者200mg/L金银花和枸杞醇提 物，发酵起始pH值为6. 0,温度为30°C，摇床转速为160r/min，发酵时间为168h。
4. 根据权利要求1或2或3所述的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于： 所述桔梗水提物的提取工艺如下：取桔梗90-110g，用水煎制煮沸25-35min，倒出药渣，补 加适量冷水于药渣中，再煮沸18-22min，倒出药汁，之后再补加适量冷水于药渣中，煮沸 18-22min，倒出药汁，合并药汁，过滤药汁，之后将过滤后的药汁于55-65°C下干燥，得到桔 梗水提物。
5. 根据权利要求1或2或3所述的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于： 所述金银花和枸杞醇提物的提取工艺如下：将金银花和枸杞按照0. 8-1. 2 :1的质量配比混 合后，30-50目粉碎，之后用纱布包好扎紧，放入酒精回流提取仪中，用2. 5-3. 5倍的乙醇提 取2. 5-3. 5h，获得萃取液，将剩余物质再加入2. 5-3. 5倍的乙醇提取I. 5-2. 5h，再次获得萃 取液，之后合并两次获得的萃取液，浓缩得到金银花和枸杞醇提稠状物；所述乙醇的体积百 分浓度为93-97%。
6. 根据权利要求1或2或3所述的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，其特征在于： 步骤（3)中所述的萃取液在静置前先加入纤维素复合酶进行酶解，酶解温度45-55°C，pH = 5. 5-6. 5,酶解时间18-22min，纤维素复合酶的加入量为萃取液的1. 5-2. 5% (W:V);所述纤 维素复合酶由纤维素酶、蛋白酶、果胶酶按比活力4. 8-5. 2:2. 8-3. 2:1. 8-2. 2混合而成。
【专利摘要】本发明涉及一种灵芝三萜酸发酵提取工艺方法，具体涉及一种能有效提高产量的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，属于生物发酵技术领域。一种灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法，包括如下步骤：(1)配置培养基：所述培养基主要由以下组分配制而成(W/V)：葡萄糖25.0-27.0g/L，玉米粉10.2-12.2g/L，麸皮粉9.8-11.8g/L和蛋白胨4.9-6.9g/L；(2)发酵培养；(3)提取分离。本发明所提供的灵芝三萜酸深层发酵提取工艺方法能有效解决现有技术中灵芝子实体栽培资源浪费，三萜酸培养提取时间长，有效提取率和纯度不高，不易进行大规模工业化生产的问题。
【IPC分类】C12R1-645, C07J9-00, C12P33-00
【公开号】CN104805170
【申请号】CN201510147874
【发明人】高益槐, 戴金玉, 郑春源, 唐文波
【申请人】安发（福建）生物科技有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月1日