基因株系的叶绿素含量低于野 生型，L5和L7的叶绿素含量约为野生型的70%，L53的叶绿素含量为野生型的56%，三个 株系的降幅均达到了极显著水平（P〈〇. 01)。
[0015] 本发明克隆了一个棉花糖基转移酶家族1中的基因，GhUGT8501，通过对其表达模 式的分析，以及转基因后代特性的研宄，鉴定它参与了植物逆境胁迫，开花时间的调控，和 衰老进程的调控，为进一步阐明其功能奠定了基础。
【附图说明】
[0016] 图1显示GhUGT8501基因的时空表达模式分析；
[0017] 图2. ABA、JA、和PEG处理后GhUGT8501基因的表达变化；
[0018] 图3显示pBI121 -GhUGT8501转基因拟南芥阳性株系的鉴定；
[0019] 图4显示转基因拟南芥衰老提前（A)，叶绿素含量（B)以及衰老相关基因的表达 (C-G) 〇
【具体实施方式】
[0020] 实验材料
[0021] 供试材料为短季棉品种中棉所10 (CCRI10，Gossypiumhirsutum)，分别取棉花的子 叶、根、茎、叶、花、顶芽、胚珠等不同组织。盛花期对主茎叶片进行挂牌标记，展平当天的为 0天，从15天开始取样，每隔天取一次，直到叶片衰老。处理试验在人工气候室中进行。所 取的样品在液氮中速冻，然后保存在-80°C冰箱中待用。
[0022] 实施例1基因克隆及转化
[0023] 一、棉花中GhUGT8501基因的克隆
[0024] 设计特异性引物从陆地棉中棉所10号中扩增出完整序列。PCR引物为：上游引物 5'-ATGGGTTCACTTGAAACCAG- 3' ；下游引物5'-CCTCACACGACTGCATTCAC- 3'。
[0025]根据TAKARA LA Taq Hot Start Version 2. 0(DRR042)说明书进行PCR扩增，然 后回收目的片段并测序。
[0026] 二、GhUGT8501基因的时空表达模式分析
[0027] 1、提取棉花品种"中棉所10号"的不同组织和不同叶龄叶片的总RNA，并分别反转 录为cDNA。
[0028] 2、以步骤1得到的cDNA的10倍体积稀释液为模板，进行荧光定量PCR。
[0029] 用于检测GhUGT8501基因的表达量的引物为：上游引物：5'-GGCGAAGCATCTCAAAGAAT-3'；下游引物：5'_ CAGAATCACCCATCACGACA-3'。用于检测内参基 因（actin)的表达量的引物对为：上游引物：5'-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3';下游引物：5'_ TGTCCGTCAGGCAACTCAT - 3'。
[0030]荧光定量PCR反应体系：10y 1 SYBR Premix Ex Tag，0.8y 1上游引物，0.8y 1下 游引物，2yl cDNA模板，6yl ddH20,0.4yl ROX Reference Dye II，总体积20ul〇
[0031] 荧光定量PCR反应程序：95°C预变性lmin ;95°C变性5s、60°C退火30s、72°C延伸 30s，40个循环；72°C延伸lOmin ;在72°C，30s处收集荧光信号。
[0032] 采用相对定量A A Ct法分析。
[0033]GhUGT8501基因在不同叶龄的叶片以及其它组织的表达情况见图1。结果表明：该 基因在成熟以及衰老叶片中（35到45天）的表达量较幼嫩叶片（15到30天）的高；在不 同组织之间，GhUGT8501在叶片、子叶、花中表达量较高，而在花芽、胚珠、茎、根和下胚轴中 表达量较低。
[0034] 为了研宄GhUGT8501基因是否对非生物胁迫有响应，对叶片进行了八种处理，即： 赤霉素、热、茉莉酸、一氧化氮供体SNP、伤害、水杨酸、脱落酸、以及PEG。结果表明，在处理 后12小时内，该基因对ABA、JA、和PEG有响应（图2)。ABA处理4小时后，GhUGT8501表 达量比0小时上调了 4倍，这一趋势一直持续到12小时（A)。JA处理8小时后，GhUGT8501 表达量比0小时上调了 15倍，到12小时回归原始水平（B)。PEG处理4小时后，GhUGT8501 上调了 3倍，8小时后高达40倍，然后这种上调趋势缓慢降低，到12小时约15倍（C)。对 于其他的5种处理方式，在取样的12小时内，该基因的表达趋势没有明显的变化。
[0035] 三、转基因拟南芥
[0036] l、PBI121-GhUGT8501植物表达载体的构建
[0037] 以中棉所10号cDNA为模板，以带有相应酶切位点的引物上游：5'-CACGGGGGACI CTAGAATGGGTTCACTTGAAACCAG-3'（下划线为Xbal酶切位点）；下游：5' -GATCGGGGAAAITC辽 AGCTCCCTCACACGACTGCATTCAC-3'下划线为SacI酶切位点），扩增得到包含GhUGT8501基因 编码区的PCR产物。
[0038] 将植物表达载体pBI121经过Xbal和SacI酶切，得到载体骨架；
[0039] 将上述载体骨架与上述目的基因片段连接。
[0040] 2、转GhUGT8501拟南芥的获得
[0041] 将质粒PBI121 -GhUGT8501转入农杆菌LBA4404感受态细胞中，得到重组菌。将 PCR检测含有质粒PBI121 -GhUGT8501 的重组菌命名为LBA4404/PBI121 -GhUGT8501。将 开花的野生型拟南芥植株已授粉的花和结的荚用剪刀剪去，将拟南芥花浸入装有渗透缓冲 液的小烧杯中浸染50s，然后将浸染过的拟南芥植株放置大塑料桶中黑暗培养，24h后于拟 南芥培养室继续培养；待果荚成熟后混合收种，得到T0代转GhUGT8501的拟南芥种子。将 T0代种子经消毒春化后在加抗生素卡那霉素的MS培养基上培养，阴性转基因株不能正常 生长，筛选得到阳性T0代转GhUGT8501拟南芥。
[0042]3、转基因后代的分子鉴定
[0043] 提取阳性T0代转GhUGT8501拟南芥的基因组DNA，以正向引物5' -GACGCACAATCCCACTATCC- 3'（与载体上35S启动子的一段核苷酸序列匹配）和反向引物 5' -CCTCACACGACTGCAITCAC- 3'为引物进行PCR扩增，以野生型拟南芥（WT)为对照。
[0044] 1%琼脂糖电泳检测，结果如图3所示，L2、L5、L7、L53可检测到目的片段，确定为 阳性T0代转基因株系；提取野生型（WT)拟南芥的基因组DNA作为对照，以同样的引物，未 得到目的片段。将阳性T0代转GhUGT8501拟南芥单株收种子，播种，筛选，直到T3代以上 纯合株系。
[0045] 实施例2GhUGT8501功能研宄
[0046] -、转GhUGT8501拟南芥开花提前
[0047] 将编号为L2、L5、L7、L53的纯合转GhUGT8501拟南芥、野生型拟南芥（WT)播种， 在长日照条件（16h光照/8h黑暗）下培养。
[0048] 转空载体拟南芥和野生型拟南芥表型一致。统计4个纯合转GhUGT8501株系和野 生型拟南芥的开花时间、莲座叶数、和茎生叶数，实验重复三次，每个株系都以野生型为参 比进行显著性分析，统计分析结果见表1。除L2外，其他3个株系（L5、L7、L53)极显著促 进拟南芥早花（P〈〇. 01)，并且莲座叶的数量也极显著减少（P〈〇. 01)，茎生叶数量的变化与 野生型相比，L53显著减少（P〈0. 05)，而其他3个株系均不明显。
[0049] 表1转基因拟南芥开花时间、莲座叶和茎生叶数目统计
【主权项】
1. 陆地棉糖基转移酶GhUGT8501，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示。
2. 陆地棉糖基转移酶基因GhUGT8501，其特征在于，编码权利要求1所述的陆地棉糖基 转移酶GhUGT8501。
3. 陆地棉糖基转移酶基因GhUGT8501，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 2所 不O
4. 包含权利要求2所述陆地棉糖基转移酶基因GhUGT8501的植物表达载体。
5. 权利要求1所述陆地棉糖基转移酶GhUGT8501的应用。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及陆地棉糖基转移酶GhUGT85O1及其编码基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明克隆了一个棉花糖基转移酶家族1中的基因，GhUGT85O1，通过对其表达模式的分析，以及转基因后代特性的研究，鉴定它参与了植物逆境胁迫，开花时间的调控，和衰老进程的调控，为进一步阐明其功能奠定了基础。
【IPC分类】C12N9-10, C12N15-82, C12N15-54
【公开号】CN104818258
【申请号】CN201510095549
【发明人】喻树迅, 黄娟, 范术丽, 宋美珍, 庞朝友, 魏恒玲
【申请人】中国农业科学院棉花研究所
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年3月4日