离状态，中华绒螯蟹卵母细胞的颜色会由黑色或紫色变为橘黄色。
[0021]3、静置I?2分钟(或更长时间，不超过60分钟)。
[0022]4、将卵母细胞及透明液转移至培养皿或载玻片上，置于底色为黑色的解剖镜下观察。结果如图1B，发现在卵母细胞的一端有一小的白色不透明的斑点。卵母细胞在透明液中继续浸泡Ihr以上，生发泡也没有透明。
[0023]I1.常规组织切片(HE法)对透明液处理的结果进行验证，方法如下:
[0024]1、取同一中华绒螯蟹的卵巢组织置于多聚甲醛固定液固定中，4°C固定24小时。
[0025]2、固定好的卵巢组织用IXPBS缓冲液洗3次，每次30分钟。冲洗完后，将样品置于甲醇中，-20°C保存备用。
[0026]3、保存的样品经不同浓度梯度的乙醇脱水，其步骤为:70%乙醇，I小时；80%乙醇，I小时；95%乙醇I，45分钟；95%乙醇11，45分钟；无水乙醇I，45分钟；无水乙醇II，45分钟。
[0027]4、二甲苯透明，其步骤为:1:1的酒精、二甲苯，40分钟；二甲苯I，15分钟；二甲苯II，15分钟。
[0028]5、浸蜡:提前I小时将1:1的二甲苯、石蜡及石蜡放置于60度烘箱中，使其充分溶解。样品浸蜡的步骤为1的二甲苯、石蜡，45分钟；石蜡I，1小时；石蜡11，2小时。
[0029]6、包埋:向叠好的纸质小盒内倒满石蜡，迅速用镊子从石蜡中将样品夹起，放入装满石蜡的纸盒内，将纸盒放置在平整的冰盒内。待纸盒内的石蜡凝固后转移至4度冰箱内，过夜。
[0030]7、修蜡:用解剖刀切除组织周围的石蜡，将其修成棱台状，然后将其固定在小木块上。
[0031]8、切片:用旋转式切片机将石蜡包埋的卵巢组织切成6微米厚的切片。
[0032]9、贴片、烘片:滴几滴清水与载玻片上，然后将切好的切片用镊子捞起，放到载玻片上，铺平。最后将玻片置于37摄氏度的烘箱中，烘片24小时以上。
[0033]10、HE染色，具体步骤为:二甲苯I，10分钟；二甲苯11，10分钟；1:1的乙醇、二甲苯，5分钟；无水乙醇，2分钟；95%的乙醇，2分钟；90%的乙醇，2分钟；80%的乙醇，2分钟；70%的乙醇，2分钟；蒸馏水，2分钟；苏木精，20分钟；流水冲洗，30分钟；1:99的盐酸、乙醇，2秒;流水冲洗，20分钟；70 %的乙醇，2分钟；80 %的乙醇，2分钟；90 %的乙醇，2分钟；0.5%的伊红，30秒；95%的乙醇，2分钟；无水乙醇，2分钟；1:1的乙醇、二甲苯，5分钟；二甲苯I，5分钟；二甲苯11，2分钟。结果如图1的C。
[0034]结果:解剖发现，生长成熟的中华绒螯蟹卵巢为深紫色或黑色，几乎充满整个腹腔。解剖镜下观察未经透明液处理的卵母细胞，呈圆形、椭圆形等形状，细胞内充满卵黄(图1A);经过透明液处理的游离的卵母细胞置于底色为黑色的解剖镜下观察，细胞呈透明状态，并且发现在卵母细胞的一端有一小的白色不透明的斑点(图1B)，经HE法证实，为卵母细胞发生偏移的生发泡(图1C)。用透明液及HE法鉴定的结果一致。
[0035]实施例2透明液处理罗氏沼虾的卵母细胞
[0036]随着卵黄的积累，罗氏沼虾卵巢逐渐发育变大，到最后整个头胸甲内几乎充满了橙黄色的卵巢。解剖镜下观察游离的卵母细胞呈圆形，椭圆等形状，细胞内充满卵黄(图1D)。透明液处理及HE检测的方法同实施例1。
[0037]透明液的配方同实施例1，取100毫克的卵巢组织置于15毫升的离心管中，加入3毫升左右的透明液，迅速剧烈震荡(100?500rpm)，使卵母细胞呈游离状态；并静置I?2分钟(或更长时间，不超过60分钟)。处理后罗氏沼虾的卵细胞颜色会变淡。
[0038]将罗氏沼虾卵母细胞用透明液处理后置于底色为白色的解剖镜下观察，细胞呈透明状态，并且发现在卵母细胞中有一不透明的黑色斑点(图1E)，HE证实其为罗氏沼虾卵母细胞的生发泡(图1F)。用透明液及HE法鉴定的结果一致。
[0039]卵母细胞在透明液中继续浸泡Ihr以上，生发泡也没有透明。
[0040]对照例
[0041 ] 用无水乙醇、冰乙酸和甲醛按照60:5:20、50:1:20、65:1:30、60:1:35等体积比混合，或者用甲醇与冰醋酸按3:1体积比混合，按实施例1和2的方法处理中华绒螯蟹和罗氏沼虾的卵巢，游离后的卵母细胞并不能出现透明状态。
【主权项】
1.一种用于快速鉴定虾蟹卵母细胞生发泡的透明液，其特征在于，由体积比60:1:30的无水乙醇、冰醋酸和甲醛组成。
2.权利要求1所述的透明液在使虾蟹卵母细胞透明方面的应用。
3.权利要求1所述的透明液在鉴定虾蟹卵母细胞生发泡方面的应用。
4.权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的虾蟹为中华绒螯蟹或罗氏沼虾。
5.一种快速鉴定虾蟹卵母细胞核的方法，其特征在于，步骤包括: (1)将虾蟹的卵巢组织与权利要求1所述的透明液混合，振荡使卵母细胞呈游离状态； (2)静置I?60分钟，查看置于透明液中的游离的卵母细胞中生发泡的状态。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述卵巢组织与透明液的用量比为10mg:1?1ml ;振荡速度为50?800rpm，振荡时间为2?20min。
7.权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤⑴中，振荡速度为100?500rpm，振荡时间为5?15min。
8.权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，静置的时间为I?5分钟。
9.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的虾蟹为中华绒螯蟹或罗氏沼虾。
10.权利要求5或9所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，振荡使卵母细胞呈游离状态并变为橘黄色。
【专利摘要】本发明涉及水产养殖领域，提供了一种能够用于快速透明虾蟹卵母细胞的透明液及用这种透明液处理和检查虾蟹卵母细胞成熟情况的方法。透明液为无水乙醇、冰醋酸和甲醛按60∶1∶30体积比的混合物。上述透明液可应用于处理虾蟹类卵母细胞，能有效的透明虾蟹的卵母细胞，上述透明液可用于快速鉴定虾蟹类卵母细胞生发泡。
【IPC分类】C12Q1-02
【公开号】CN104818314
【申请号】CN201510241280
【发明人】丘高峰, 刘志强
【申请人】上海海洋大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月13日