)连接液，冰浴 30min，42°C 90s，冰浴2min，加入LB培养基800 μ 1，37°C振荡培养1小时。菌液涂布于含 有100 μ g/ml卡那霉素的LB平板上，37°C培养12-14h。挑取白色菌落提取质粒并做双酶 切检测，酶切体系（1〇μ1)如下：CldH 2O 4μ1，YM01-5/pET24a(+)质粒 DNA 4μ1，BamH I 0.5 μ 1，Xhol I 0.5 μ 1，IOXBuffer 1 μ 1。琼脂糖凝胶电泳中出现2409bp特异带者为阳 性转化克隆。
[0024] 实施例3 :重组β -琼胶酶的制备
[0025] 将重组表达工程菌YM01-5/pET24a(+)/BL21 (DE3)接种至含有终浓度为100 μ g/ ml的硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C培养箱中150rpm振荡培养过夜。将过夜 培养的菌液转接至新鲜LB液体培养基中，并加入终浓度相同的硫酸卡那霉素或者氨苄 青霉素，于37°C培养箱中150rpm振荡培养，至细菌达到对数生长期，即OD 6cJ直在0. 4~ 0. 5之间。向菌液中加入终浓度为0.1 mM的IPTG进行诱导表达，于16°C培养箱中150rpm 振荡培养12_2411。将2501111发酵液中离心（4°〇12,000印111离心101^11)获得的菌体用 12. 5ml的IXNi柱结合缓冲液重悬。破碎菌体，离心收集上清。用灭菌后的0. 22mm的 滤器过滤收集的破碎上清，待用。将步骤1)中获得的破碎上清加入层析柱中，冰浴环境 中水平震荡lh，并不断上下颠倒以便重组蛋白与Ni琼脂糖充分结合。用25ml的IXNi 柱洗涤缓冲液 I (20mM Tris-HCl, pH8. 0 ;20mM 咪唑；0· 5M NaCl ;0· 1 % Tween X-100)洗 涤，再用 I XNi 柱洗涤缓冲液 2 (20mM Tris-HCl, pH8. 0 ;50mM 咪唑；0. 5M NaCl)、I XNi 柱洗涤缓冲液3(20mM Tris-HCl，pH8. 0 ;100mM咪唑；0. 5M NaCl)、lXNi柱洗涤缓冲液 4 各 5ml (20mM Tris-HCl, pH8. 0 ;150mM 咪唑；0. 5M NaCl)洗涤，用 IXNi 柱洗涤缓冲液 5(20mM Tris-HCl，pH8. 0;250mM咪唑；0. 5M NaCl)收集洗涤液。透析收集所得的样品，利 用SDS-PAGE检测纯化所得的重组蛋白的纯度。用Bradford法测定目的蛋白的浓度，分装 后将蛋白冻于_20°C保存以备用。
[0026] 实施例4 :重组β -琼胶酶活性检测及其酶学性质
[0027] 取20 μ 1纯化蛋白到2. 5%的琼脂糖板上，将对照组同样处理。于37°C培养箱中 正置3个小时后，加入卢戈氏碘液，30s后倒掉，然后用卢戈氏碘液染色，结果可在棕色背景 上看到明显的透明圈，说明纯化的重组酶具有琼胶降解活性。用DNS试剂法测得此琼胶酶 的酶学性质如下：
[0028] 1、最适温度为37°C
[0029] 2、温度稳定性：0°C -100°C下放置30min，琼胶酶YM01-5在(TC -37°C能保持80% 以上的活性。
[0030] 3、最适 pH 为 9.0
[0031] 4、pH稳定性：在pH6-10之间保持较高的pH稳定性，在该范围的pH缓冲液中放置 12h后，YM01-5仍能保持80%以上的酶活力不同离子对酶活的影响：SDS、Ni 2+对重组琼胶 酶YM01-5有很强的抑制作用（>80%)。Na+、K+、和Urea在低浓度（ImM)下对重组琼胶酶的 活力具有轻微的抑制作用，在高浓度（IOmM)下具有明显的促进作用。Mg 2+和Fe3+对YM01-5 的活性具有促进作用，且随着浓度升高促进作用更加明显。除此以外，ImM的Cu 2+和EDTA对 重组琼胶酶YM01-5的活性具有促进作用，但是高浓度的Cu2+和EDTA(IOmM)对其活性有抑 制作用酶促动力学参数：Km = 222. 2mg/ml ;Vmax = 20. 8U/mg
[0032] 实施例5 :表达产物用于制备新琼寡糖
[0033] 在170 μ 1琼脂糖溶液中（pH = 8,浓度为0· 25% )加入30 μ 1重组琼胶酶酶液 50°C温浴不同时间（5min，lOmin，15min，30min，lh，3h，6h，18h，24h)后离心，取上清、点样 于薄层层析板，
[0034] ，用风筒吹干，置于自制层析缸中展层。展开剂配方为正丁醇：冰乙酸：水= 2:1:1(体积比）。待前沿线到达离层析板顶端Icm处时停止展层，烘箱中干燥。最后往层 析板喷洒显色剂（2%二苯胺丙酮溶液5ml，2%苯胺丙酮溶液5ml，三氯乙酸5g)，105°C烘箱 中显色。此重组琼胶酶降解的琼脂糖的产物只有一种，且产物浓度随着时间的延长而增大， 因此推测YM01-5是一种外切酶（见图1)。
[0035] 使琼胶酶作用于20mM Tris-HCl缓冲液（pH 8. 0) 0. 25 %琼脂糖溶液24h。 12000rpm离心10min获得上清，进行柱分离层析，获得反应产物，冻干后进行质谱分析，确 定终产物为新琼二糖（见图2)。
【主权项】
1. 一种e-琼胶酶，其特征在于，所述的e-琼胶酶包含有： 1) 氨基酸序列为SEQ ID NO : 1的e -琼胶酶； 2) 在1)进行取代、缺失、添加一个或几个氨基酸形成的，且具有1)中酶学性质的 0 -琼胶酶。
2. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的e -琼胶酶。
3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。
4. 一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒用于重组表达权利要求1所述的0 -琼 胶酶。
5. 如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求2所述 的基因。
6. -种重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌转化有权利要求4所述的重 组质粒。
7. 如权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌的保藏编号 为 CCTCC N0:M2015164。
8. 权利要求1所述的0 _琼胶酶在制备新琼寡糖中的应用。
9. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的新琼寡糖为新琼二糖。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种β-琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1；编码上述β-琼胶酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO：2。本发明的β-琼胶酶能够特异性地降解琼胶产生唯一的降解产物新琼二糖。本发明的大肠杆菌重组株YM01-5/pET24a(+)、BL21(DE3)所表达的重组β-琼胶酶，表达水平高，易于纯化，所以通过本发明可以大量生产重组β-琼胶酶，成本低。CCTCC NO:M201516420150325
【IPC分类】C12R1-19, C12P19-12, C12N15-56, C12N9-42, C12P19-14, C12N15-70
【公开号】CN104862294
【申请号】CN201510205610
【发明人】史晓翀, 张晓华, 崔方元
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年4月25日