一种用高速逆流色谱制备高纯度蔗果聚糖单体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从低聚果糖中制备高纯度蔗果聚糖单体的方法，具体是一种用高速逆 流色谱制备高纯度蔗果聚糖单体的方法。 【背景技术】
[0002] 蔗果低聚糖，又称低聚果糖（FOS)，是指1~5个果糖基以β-2,1键连接在蔗糖的 D-果糖基上而形成的蔗果三糖（GF2)、蔗果四糖（GF3)、蔗果五糖（GF4)和蔗果六糖（GF5) 的混合物，如式1所示。它是一种存在于水果、蔬菜、蜂蜜等物质中的天然活性成份，是优良 的水溶性膳食纤维。低聚果糖作为益生元的代表，除具有一般功能性低聚糖的物理化学性 质外，最引人注目的生理特性是它能明显改善肠道内微生物种群比例，具有润肠通便、增强 免疫力、促进矿物质的吸收、改善肠道菌群、双相调节微生态平衡的"整肠"生理功能。甜度 为蔗糖的〇. 3-0. 6倍，是一种清甜可口的功能性食品配料，以其安全性和显著功能得到世 界范围的公认。
[0003]
[0004] 由于低聚果糖具有优异的生理学功能，因此普遍地被用作保健食品配料，在我国 低聚果糖亦被用做食品配料及营养强化剂。但是，高纯度蔗果聚糖单体的制备难度非常大， 导致相关产品质量很难控制。中国专利CN102408457中采用硅胶柱色谱制备蔗果三糖和蔗 果四糖，纯度只能达到90 %，无法作为高纯度对照品使用。王涛等人采用聚丙烯酰胺凝胶柱 分离得到了高纯度的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，但是洗脱速度低（0. 2ml/min)、洗脱时 间需要500分钟，制备效率太低，不适合工业化的生产方式。目前，尚未见到可适用于工业 化生产的同时制备三种高纯度蔗果聚糖单体的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用高速逆流色谱技术从低聚果糖中分离得到纯度 98%以上的蔗果三糖、鹿果四糖、鹿果五糖的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] -种从低聚果糖中制备蔗果聚糖单体的方法，该方法包括以下步骤：
[0008] (1)对低聚果糖的羟基进行保护，得到低聚果糖衍生物；
[0009] (2)采用高速逆流色谱对低聚果糖衍生物进行分离，得到蔗果三糖衍生物、蔗果四 糖衍生物和蔗果五糖衍生物；
[0010] (3)去除蔗果三糖衍生物、蔗果四糖衍生物和蔗果五糖衍生物的羟基保护基，得到 蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖；
[0011] (4)将蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖分别经S印hadex LH-20纯化。
[0012] 进一步地，所述步骤（1)具体是：用乙酰基、甲基或苄基保护低聚果糖的羟基，得 到低聚果糖衍生物，该低聚果糖衍生物低极性。
[0013] 进一步地，所述步骤（2)具体是：将高速逆流色谱的溶剂体系混合后静置分层，上 相为固定相，下相为流动相，低聚果糖衍生物用上相和下相的混合液溶解后，用高速逆流色 谱仪分离，得到蔗果三糖衍生物、蔗果四糖衍生物和蔗果五糖衍生物。
[0014] 进一步地，所述高速逆流色谱的溶剂体系由惰性溶剂、正丁醇、甲醇和水，或者惰 性溶剂、正丁醇、乙醇和水组成。
[0015] 进一步地，所述惰性溶剂是石油醚、正己烷和环己烷的至少一种。
[0016] 进一步地，所述惰性溶剂、正丁醇、甲醇和水的体积比是2-4 :1-3 :1_3 :3_6,所述 惰性溶剂、正丁醇、乙醇和水的体积比是2-4 :1-3 :1-3 :3-6。
[0017] 进一步地，所述步骤（2)的蔗果三糖衍生物、蔗果四糖衍生物和蔗果五糖衍生物 用HPLC测定纯度。
[0018] 进一步地，所述步骤（4) Sephadex LH-20纯化的洗脱溶剂是甲醇。
[0019] 进一步地，该方法还包括：用HPLC测定步骤（4)纯化后的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗 果五糖的纯度。
[0020] 进一步地，具体的色谱条件是：X Amide色谱柱（5μπι，4. 6_X250mm)，检测器： 蒸发光散射（ELSD)，柱温：室温，流速：1. OmL/min，进样量：10 μ 1，流动相：乙腈：水=75 : 25(体积比）。
[0021] 进一步地，该方法还包括：对步骤（4)纯化后的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖进 行 MS，1H-NMR 和 13C-NMR 的测定。
[0022] 进一步地，具体是用应用Agilent 5973Ν质谱仪进行MS测定，用Varian 600MHz 核磁共振波谱仪进行1H-NMR和13C-NMR的测定。
[0023] 用乙酰基保护低聚果糖羟基的方法是：用吡啶溶解低聚果糖后加入醋酐，室温下 反应24小时，然后用旋转蒸发仪减压浓缩，得到黄色糖浆状的乙酰化低聚果糖。
[0024] 用甲基保护低聚果糖羟基的方法是：用氢氧化钠溶液溶解低聚果糖，冰水浴下滴 入硫酸二甲酯，室温下搅拌反应6小时，用乙酸乙酯萃取后浓缩，得到浅黄色糖浆状的甲基 化低聚果糖。
[0025] 用苄基保护低聚果糖羟基的方法是：用二甲基甲酰胺溶解低聚果糖，加入氢氧化 钠，冰水浴下滴加溴苄，完毕后室温下反应3小时，加水洗涤后用乙酸乙酯萃取，浓缩，得到 浅黄色的苄基化低聚果糖。
[0026] 分离溶剂系统的选择：根据各种溶剂的极性、粘性、比重、溶解度等因素，设计一系 列溶剂系统，然后按溶剂系统的比例，配置20mL溶剂，分别吸取上下相各lmL，加入低聚果 糖衍生物lmg，充分振摇，静置分层，分取上下层溶液，用高效液相色谱法测定上下层所含 蔗果三糖衍生物、蔗果四糖衍生物和蔗果五糖衍生物的浓度，即可求得三者在该溶剂系统 中的分配系数K，K = Cs/Cm(Cs表示溶质在上相的质量浓度，Cm表示溶质在下相的质量浓 度）。选取K值在0. 5 - 2范围内的溶剂系统作为分离制备系统。
[0027] 高速逆流色谱采用上海同田生物技术股份有限公司生产的TBE-300A制备型逆流 色谱仪，逆流色谱仪由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱（由聚四氟乙烯 管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，它的连接顺序为：柱塞泵一进样阀一 色谱分离柱一紫外检测仪一记录仪。首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流 速灌满半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使色谱仪的色谱分离柱正转， 转速达800r/min时，设置流动相流速为2. OmL/min，开始泵流动相，待流动相流出色谱分离 柱时，称取一定量低聚果糖衍生物放入上相、下相的混合液中溶解，用注射器注入逆流色谱 仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。根据检测器紫外光 谱图，对分离的每个峰进行收集，用高效液相色谱（HPLC)测定纯度，分别收集不同成分。
[0028] 用高效液相色谱（HPLC)测定蔗果三糖衍生物、蔗果四糖衍生物和蔗果五糖衍生 物纯度的色谱条件是：Shim-pack VP-ODS色谱柱（5 μηι，4. 6mmX250mm)，检测器：蒸发光散 射（ELSD)，柱温：室温，流速：1.0mL/min，进样量：10μ1，流动相：甲醇：水=70 :30(体积 比）。
[0029] 去乙酰基的方法是：分离得到的乙酰化蔗果聚糖单体用甲醇溶解在圆底烧瓶中， 然后加入甲醇钠室温反应1小时，减压蒸干得到蔗果聚糖单体。
[0030] 去甲基的方法是：分离得到的甲基化蔗果聚糖单体用二氯甲烷溶解在圆底烧瓶 中，然后加入三溴化硼，室温下反应6小时，减压蒸干得到蔗果聚糖单体。
[0031] 去苄基的方法是：分离得到的苄基化蔗果聚糖单体用甲醇溶解在圆底烧瓶中，氮 气保护下加入10%的钯碳作为催化剂，然后室温下通入氢气催化还原12小时，滤除不溶物 后减压蒸干溶剂，得到蔗果聚糖单体。
[0032] 对鹿果聚糖单体纯化的方法是：采用Sephadex LH-20分别对鹿果聚糖单体进行 纯化，洗脱剂是甲醇，收集目标化合物，减压浓缩，得到高纯度蔗果聚糖。
[0033] 本发明的有益效果是：
[0034] 1本发明从低聚果糖中分离得到的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度均在 98%以上，可作为高纯度对照品使用。
[0035] 2本发明的分离量大，可以放大生产，每次能够分离200mg样品。
[0036] 3本发明的制备方法操作简便、分离时间短、回收率高、样品无损失、分离环境缓 和、溶剂可回收利用、生产成本低。
【附图说明】
[0037] 图1是实施例1中乙酰化低聚糖的高速逆流色谱分离的色谱图。
【具体实施方式】
[0038] 实施例1
[0039] 按照以下步骤制备高纯度低聚果糖：
[0040] (1)乙酰化保护：将5g低聚果糖溶解在50mL吡啶中，加入0.2mol醋酐，室温下反 应24小时，然后用旋转蒸发仪减压浓缩，得到黄色糖浆状的乙酰化低聚果糖。
[0041] (2)高速逆流色谱的溶剂体系选用石油醚：正丁醇：甲醇：水=3 :2 :1 :4(体积 比）体系，将上述溶剂体系配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下 两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取150mg乙酰化低聚果糖溶解于5mL上相和5mL 下相的混合物中待用。采用上海同田生物技术股份有限公司生产的TBE-300A制备型逆流 色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱（由聚四氟乙烯管多层 缠绕形成的螺旋管柱，容量为300mL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵 以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控