一种百两金皂苷b对照品的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及药品的质量控制方法，具体是指百两金皂苷B原 料或其制剂的分析检测方法。
【背景技术】
[0002] 百两金（Ardisia crispa (Thunb. ) DC. A.)是紫金牛科（Myrsinaceae)紫金牛 属（Ardisia Sw.)常绿灌木植物，以全株入药，具有清咽利喉、散淤消肿、舒筋活血、祛痰 止咳和提脓生肌的功效，、我国民间多用于治疗咽喉痛、扁桃体炎、肾炎水肿、跌打损伤、风 湿疼痛、白浊、骨结核、劳伤咳血、痈疔和毒蛇咬伤等。现代药理研宄表明，本药材具有细 胞毒活性和抗肿瘤作用，同时具有抗炎、抑菌、收缩子宫、抗氧化等活性作用。百两金皂苷 B(ardisiacrispin B)是该药材主要活性成分之一，其化学结构式如下：
[0003]
[0004]目前对百两金等同属植物的研宄热点主要集中在化学成分、药理作用和临床应用 等方面，也有人建立了百两金药材中岩白菜素和百两金皂苷A含量测定的方法（侯金玲 等.HPLC-ESLD测定瑶药竹叶风中岩白菜素和百两金皂苷A含量的方法研宄[J]广西医科 大学学报2014, 31 (I) :50-54)，但由于缺乏对照品，一直未见百两金皂苷B的定量分析方 法。
[0005] 百两金皂苷B的化学名称为西克拉敏A 3-0-α -鼠李吡喃糖-(1 - 2)-β -D-葡 萄吡喃糖-(1 - 4) _[ β -D-葡萄吡喃糖-(1 - 2)-]-a -L-阿拉伯吡喃糖苷，是存在于紫金 牛科紫金牛属植物百两金、朱砂根、红毛走马胎等多种植物中的有效成分，在深入研宄开发 该活性成分的过程中，需要将其提取制备成含量大于90%的中药1类新药原料，并进而制 备成制剂。这就需要首先分离得到百两金皂苷B单体，并按照对照品研宄技术指导原则进 行纯化及结构鉴定。本发明采用制备高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-ELSD)建立起百两 金皂苷B化学对照品的制备方法，为进一步的深入研宄和新药开发提供新的参考。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种百两金皂苷B化学对照品的制 备方法。
[0007] 本案发明人通过对百两金皂苷B化学成分进行文献查阅和实验研宄，发明了百两 金药材回流提取、大孔吸附树脂分离纯化，高效液相色谱制备百两金皂苷B的方法，经薄层 色谱多个展开及显色系统分离均显示一个斑点，采用HPLC-ELSD峰面积归一化法计算，其 质量浓度大于98%，符合中药定量分析用化学对照品纯度的质量要求，因而完成了本发明。
[0008] 本发明的技术方案是以制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的含乙醇或 乙腈水溶液为洗脱体系，获得纯度大于98%的百两金皂苷B化学对照品；具体步骤为：
[0009] 1)取百两金药材，粉碎成颗粒，加60%~80%的乙醇回流提取，滤过，减压回收醇 得提取液；
[0010] 2)将提取液上大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用用浓度低 于20%的乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用80%乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集 洗脱液，减压浓缩干燥得浸膏粉；
[0011] 3)将2)的浸膏粉用制备液相的流动相溶解使成为过饱和溶液，离心，取上清 液，用制备型高效液相色谱分离纯化；色谱条件：以反相化学键合相(： 8或C 18为填充剂，甲 醇-水或乙腈-水为流动相，在线紫外监测，波长为205nm~210腹，收集目标峰直接浓缩干 燥，或用甲醇重结晶即可得到纯度大于98%的百两金皂苷B。
[0012] 根据前述的制备方法，其中，所述的回流提取溶剂为60%~80%乙醇，加入量为 10倍量药材，回流提取3次，每次1. 5~2小时。
[0013] 根据前述的制备方法，其中，所述的大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树 脂。
[0014] 根据前述的制备方法，其中，所述的百两金皂苷B洗脱液收集后，减压浓缩，温度 控制在55~65°C ;干燥采用低温干燥或低温冷冻干燥。
[0015] 根据前述的制备方法，其中，所述的制备HPLC洗脱体系的乙醇与水体积比为 62 : 38~72 : 28;乙腈与水的体积比为30 : 70~40 : 60。
[0016] 根据前述的制备方法，其中，所述的HPLC的流动相中甲醇与水的体积比为 62 : 38~72 : 28;乙腈与水的体积比为30 : 70~40 : 60,优选甲醇-水的体积比为 60 : 40,乙腈-水的体积比为35 : 65,考虑安全性，优选甲醇-水系统为HPLC制备用流动 相。
[0017] 本发明制备的百两金皂苷B经高分辨质谱（HR-FAB-MS)给出精确分子量为1074， 其碳、氢核磁共振信号根据gCOSY，HMQC，HMBC所显示的相关关系得到了归属，结构鉴定为 西克拉敏A 3-0-α -鼠李吡喃糖-(1 - 2)-β -D-葡萄吡喃糖-(1 - 4) _[β -D-葡萄吡喃 糖-(1 - 2)-]-a-L-阿拉伯吡喃糖苷。
[0018] 本发明制备的百两金皂苷B经高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD)纯 度检查，不同色谱柱和流动相测定结果均为一个色谱峰，以HPLC-ELSD峰面积归一化法测 定，其质量分数均大于98%，符合含量测定用中药化学对照品的要求。
[0019] 而且本发明药材提取完全，所需有机溶剂少，溶剂无毒无污染。
【附图说明】
[0020] 图1为百两金皂苷B的制备HPLC-UV色谱图
[0021] 图2为百两金皂苷B的HPLC-ELSD纯度检测色谱图
【具体实施方式】
[0022] 以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明，依据现有技术，本 发明的实施方式并不限于具体实施例。
[0023] 仪器、试药与样品
[0024] 高效液相色谱仪（美国安捷伦1100系列），包括在线真空脱气机（G1322A)， 四元梯度泵（G1311A)，自动进样器（G1313A)，柱温箱（G1316A)，DAD检测器（G1314A)， Chemstation色谱工作站；Alltech ELSD 2000型蒸发光散射检测器；制备型高效液相色谱 仪（美国贝克曼库尔特BECHMAN 125P型），包含SYSTEM GOLD 125P Solvent Module和 166p Detector等；Milli-Q超纯水器（美国Milipore公司）；Microfuge 18台式离心机（美国贝 克曼库尔特有限公司）；KQ-500DE超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司，功率300W，频率 40kHz) ;BP-210D型电子分析天平（德国赛多利斯，十万分之一）；过滤装置（Autoscience) 及微孔滤膜（〇· 45 μ m)。分析色谱柱：Waters Symmetry C18 (150mm X 4. 5mm，5 μ m); Phenomenex Gemini C18 (150mmX 4. 5mm，5 μ m) ；Alltech Altimma C18 (250mmX 4. 5mm, 5 ym);制备色谱柱：BECHMAN UL TRAPREP C18(21. lmmX150mm，10 μπι);保护拄：phenomnex C18〇
[0025] 实施例1
[0026] I.对照品的制备
[0027] 1)取百两金药材，粉碎成颗粒，加10倍量的60 %乙醇回流提取2小时，重复提取 3次，滤过，合并滤液并减压回收乙醇得百两金提取物；
[0028] 2)将提取液上D141大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用用浓 度低于20%的乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；用80%乙醇洗脱至洗脱液近无色， 收集洗脱液，减压浓缩干燥得百两金浸膏粉；
[0029] 3)将2)的浸膏粉用制备液相的流动相溶解使成为过饱和溶液，离心，取上清 液，用制备型高效液相色谱分离纯化；色谱条件：以反相化学键合相(： 8或C 18为填充剂，甲 醇-水或乙腈-水为流动相，在线紫外监测，波长为205nm，色谱图见图1，收集目标峰直接 浓缩干燥，或用甲醇重结晶即可得到纯度大于98 %的百两金皂苷B (产率1. 64% )。
[0030] 2.对照品的结构鉴定
[0031] 上述百两金皂苷 B 为白色粉末，熔点：263_265°C。[a]25D=-23.5(Me0H，0.24)。
[0032] 百两金皂苷B的高分辨质谱（HR-FAB-MS)给出精确分子量:m/z 1097. 5432 [M+Na]，对应分子式为！C53H86O22Na (分子量计算值为：1097. 5509)。
[0033] 百两金皂苷B的13C-NMR谱给出53个碳信号，其中30个信号为苷元碳信号，23个 信号为糖残基碳信号。30个苷元信号中有6个为角甲基碳信号（DEPT谱信号）：δ 16. 1(C， 25-C)，16. 2 (C，24-C)，18. 0 (C，26-C)，19. 3 (C，27-C)，24. 0 (C，29-C)和 27. 7 (C，23-C) ; 1 个 醛基碳信号：S 207. 9(C，30-C) ;1个环醚亚甲基碳信号：δ 75. 8(CH2,28-C)。1H-NMR谱也显 示了 6 个角甲基氢信号：δ 〇· 72 (3H，s)，0· 80 (3H，s)，I. 06 (3H，s)，I. 17 (3H，s)，0· 91 (3H，s) 和0. 94 (3H，s) ; 1个醛基氢信号：δ 9. 75 (1H，s)。上述1H，13C-NMR谱数据为该化合物苷元 的特征信号；将百两金皂苷B的 1Η-，13C-NMR谱数据与文献对照，并结合百两金皂苷B的个 gCOSY，HMQC，HMBC，NOESY等二维核磁共振谱分析，最终确定其苷元为西克拉敏A (cyclamine A)；
[0034] 百两金皂苷B的1H-，13C-NMR谱还显示了 4个糖残基的端基碳、氢信号： δ 100. 1 (鼠李糖，C-1)，101.9(匍萄糖 _1，C_1)，103. 0 (阿拉伯糖，C-1)，103.6(匍萄糖 _2， C-1)和 δ 5. 09(1H，br. s，鼠李糖，H-1)，4. 44(1H