时间的损失来评估CBPBHA复合物的盘样本（6mm直径X 2mm厚）的体 外降解速率。在37°C下在静态条件下将样本安置在磷酸盐缓冲盐水（PBS) (pH 7. 4)中多达 24周。每周更换PBS以确保pH不下降至低于7。在称重之前，用去电离（DI)水充分冲洗 样本并冻干。通过比较初始重量（Wtl)与在1、2、4、8、12和24周测量的重量（Wt)来计算重 量损失，如等式（1)中所示：
[0141] 重量损失=(Wtl-Wt)/WtlXlOO % (1)。
[0142] 结果以平均值土 一个标准偏差（η = 6)形式显示于图4中。
[0143] 使用由以下（mmol)组成的4X改进模拟体液（SBF)溶液评估CBPBHA复合物的体 外矿物化：Na+(142. 0)、K+(5. 0)、Mg2+(I. 5)、Ca2+(2. 5)、CF (103)、HCCV(10. 0)、HPO广（1. 0) 和S042_(0.5)，其中使用LOMNaOH调整pH至7.0以加速结果。简而言之，在37°C下使复 合物盘（6mm直径X 2mm高度）浸渍在IOmL SBF中多达15天。每隔一天更新SBF以维 持矿物化期间的离子浓度和pH。在孵育各种时期之后，用DI水仔细洗涤试样以移除任何 可溶性无机离子，并且在空气中干燥。接着用银涂布样本，并且在扫描电子显微镜（SEM) (Hitachi, Pleasanton, CA, USA)下观察。通过能量分散X射线（EDX)分析来分析化学计量 Ca/P摩尔比，并且测定为I. 39±0. 25。如图5中所说明，所有CBPBHA复合物都诱导快速矿 物化。图5中标记为A-UA-2和A-3的图像分别对应于在0、3和15天时的CBPBHA-0。类 似标记流程用于图5中的其它复合物。
[0144] 实施例3
[0145] 促进骨生长的方法
[0146] 如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。在6孔板 中，在2X IO5个细胞/孔（第0天）的密度下，在生长培养基中培养源于6周龄雄性 Sprague-Dawley大鼠的骨髓基质细胞（BMSC)，所述生长培养基含有补充有10% (V/V)胎牛 血清（FBS)、0. 25μ8/ιΛ两性霉素 B以及1% (V/V)青霉素和链霉素的α最低必需培养基 (α MEM)。在第3天，将生长培养基更换成由以下组成的成骨培养基：补充有10 %胎牛血清、 KT7M 地塞米松、50yg/mL 抗坏血酸（Sigma)、5mM|3-甘油磷酸醋（Sigma)、0. 25yg/mL 两 性霉素 B、1 %青霉素和链霉素、以及各种浓度的柠檬酸（0 μ M、2 μ M、20 μ M、200 μ M、ImM和 5mM)的α MEM。在成骨诱导12天之后，BMSC培养物用Von Kossa染色进行染色，并且通过 光学显微术来成像。以倒置显微镜对每孔的钙结节的数目计数。也计算钙结节的总面积。 结果显示于图6A-6C中。图6A说明Von Kossa染色的显微镜图像。图6B说明观察到的钙 结节的数目。图6C说明钙结节的总面积。发现所有补充有柠檬酸盐的培养基都以剂量依 赖性方式促进钙结节形成。20 μ M的柠檬酸盐浓度诱导最高数目的具有较大尺寸的钙结节 (图6Α中黑色），而对照培养基不促进可见钙结节形成。
[0147] 实施例4
[0148] 促进骨生长的方法
[0149] 如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。在补充有10% FBS 以及 1 % 青霉素和链霉素的 EMEM(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)中培养 MG-63细胞（ATCC, Manassas, VA, USA)。在50 %汇合时将MG-63细胞接种在6孔板中， 并且用含有不同浓度的柠檬酸（0μM、10μM、20μM、50μM、100μM和 200 μM)的EMEM 培养。在4天时，溶解细胞，并且使用ALP底物试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA, USA) 测定碱性磷酸酶（ALP)的存在。相对于样本中存在的如通过picogreen测定（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)测定的总DNA量使ALP水平标准化。结果显示于图7中。
[0150] 在其它实验中，如上所述培养和接种MG-63细胞或MSC细胞，其中培养基含有 0以]?、2(^]\1、10(^]\1、20(^]\1、100(^]\1或 200(^]\1柠檬酸。在各种时间点，如第3天、第7 天、第10天、第14天和第21天，测定细胞的ALP的存在。结果显示于图8A和8B中。
[0151] 实施例5
[0152] 促进骨生长的方法
[0153] 如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。在补充有10% FBS以及1%青霉素和链霉素的杜贝卡氏改良依格氏培养基（DMEM)中培养人间质干细胞 (hMSC) (Lonza Walkersville Inc. ,USA)。对于分化，将 hMSC 转换至成骨培养基（OGM)中， 所述成骨培养基包括进一步补充有KT7M β -甘油磷酸酯和50 μ M抗坏血酸-2-磷酸酯的 先前基于DMEM的培养基。在80-90 %汇合之后，将hMSC细胞在IO4个细胞/毫升的密度下 接种于96孔板中。在调整pH至7. 4之后，添加以柠檬酸形式计算的体积的柠檬酸盐至生 长培养基中以获得生长培养基中最终柠檬酸盐浓度20μΜ、200 μΜ或2000 μΜ。在37°C下 在5% CO2下用补充有柠檬酸盐的培养基孵育hMSC。每隔一天更换培养基。在预定时间点 (添加梓檬酸盐后7天和14天）时，遵循制造商方案（Bio-rad Laboratory, USA)，通过蛋 白质印迹测定来测定并比较骨桥蛋白（OPN)水平。结果显示于图9中。如图9中所说明， 柠檬酸盐和OPN表达以剂量依赖性关系密切相关。
[0154] 实施例6
[0155] 促进骨生长的方法
[0156] 如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。在补充有10% FBS以及1%青霉素和链霉素的杜贝卡氏改良依格氏培养基（DMEM)中培养人间质干细胞 (hMSC) (Lonza Walkersville Inc. ,USA)。对于分化，将 hMSC 转换至成骨培养基（OGM)中， 所述成骨培养基包括进一步补充有KT7M地塞米松、KT2M β-甘油磷酸酯和50 μ M抗坏血 酸-2-磷酸酯的先前基于DMEM的培养基。在80-90 %汇合之后，将hMSC细胞在IO4个细胞 /毫升的密度下接种于96孔板中。在调整pH至7. 4之后，添加以柠檬酸形式计算的体积的 柠檬酸盐至生长培养基中以获得生长培养基中最终柠檬酸盐浓度20 μM。在37°C下在5% CO2下用补充有柠檬酸盐的培养基孵育hMSC。每隔一天更换培养基。在预定时间点（添加 朽1檬酸盐后7天、14天和21天）时，通过Von Kossa染色来染色培养物，接着通过光学显微 镜来检查以检测钙沈积物的形成。结果显示于图10中。如图10中所说明，补充外源性柠 檬酸盐能够促进在分化hMSC培养物中形成钙沈积物。
[0157] 实施例7
[0158] 促进骨生长的方法
[0159] 如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。在95 %空 气和5 % 0)2下，在24孔板中在高葡萄糖杜贝卡氏改良依格氏培养基（GIBCO, Grand Island, NY, USA)中于 CBPB-100、CBPBHA-100、CBPBHA-90 和对照玻璃上培养 C2C12 细胞 (ATCC，Manassas, VA，USA)，所述培养基补充有10 %胎牛血清、100单位/毫升青霉素和 100 μ g/mL链霉素。使用RNeasy小型试剂盒（QIAGEN，Valencia, CA, USA)纯化来自C2C12细 胞的总 RNA。使用 TaqMan One-Step RT-PCR MasterMix 试剂（Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)，使 RNA 经受定量实时 RT-PCR。通过 ABI 7500 实时 PCR 系统（Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)来分析相对转录物水平。相对于甘油醛-3-磷酸脱氢 酶（GAPDH)水平使转录物水平标准化。所有实验都一式两份进行，并且重复三次。通过 用BMP-2(R&D，Minneapolis，丽，USA)处理来诱导成骨细胞自C2C12细胞分化。在达到 60-80%汇合之后，细胞用300ng/mLBMP-2处理0、6、12、36和48小时。如先前所述分析 Osterix(OSX)和碱性磷酸酶（ALP)基因表达水平。使用扫描电子显微术观察C2C12细胞的 形态。结果显示于图IlA-C中。
[0160] 在24小时之后，细胞于探宄的所有CBPBHA复合物上都形成单层（图11A)。此外， 相较于单纯玻璃对照，在培养48小时之后，CBPB-100上的ALP和OSX基因表达水平分别增 加35%和37%。在将HA并入CBPB掺合物中的情况下，ALP和OSX基因表达水平进一步增 加。相较于单纯玻璃对照，在培养48小时之后，用CBPBHA-90复合物涂布的板上的ALP和 OSX基因表达分别增加362 %和191 %，并且用CBPBHA-100涂布的板上的表达水平分别增 加336 %和290%。当相较于CBPB-100涂布的板时，在48小时之后，CBPBHA-90复合物上 的ALP和OSX表达分别增加243%和113%，而CBPBHA-100复合物上的ALP和OSX表达分 别增加224%和185% (图IlB和11C)。
[0161] 实施例8
[0162] 促进骨生长的方法
[0163] 如下执行根据本文所述的一些实施方案的促进骨生长的方法。12只称重在2. 3与 2. 7kg之间的新西兰白兔用于评估CBPBHA-100和CBPBHA-90复合物的生物相容性和骨整 合性质。将圆柱形样本植入兔膝的侧向股骨髁中。在植入6周之后，微型CT图像显示植入 物和周围新骨组织完全融合，如图12A和12B中所见。图12A对应于CBPBHA-100,而图12B 对应于CBPBHA-90。另外，观察到新形成的骨在最初不存在骨的骨髓腔中与植入物接触。此 外，在植入物周围不存在慢性炎症（纤维囊形成）或退行性变化的迹象。根据总体组织学 检查，植入物看起来与周围骨良好整合。未检测到植入物松弛，如对周围骨组织的甲苯胺染 色和von Kossa染色中所示。骨与植入物接触（BIC)结果指示骨接触植入物（骨整合）高 达94. 74%，如图13中所见。图13说明在植入后6周时，CBPBHA-90植入物与侧向股骨髁 的周围骨的2-D微型CT图像。此外，在未脱钙骨的界面处未观察到骨再吸收。此外，在植 入物和周围组织的界面处未发现阳性染色的巨噬细胞。
[0164] 所有动物实验都依照由南方医科大学的动物护理和使用委员会 (Guangzhou, CHINA)核准的方案进行。将动物随机分成2组，并且通过氯胺酮（40mg/ kg頂）和甲苯噻嗪（5-7mg/kg頂)，补充以异氟烷（1-2 %吸入）来进行麻醉。接 着，在侧膝上产生1.5cm内侧切口以暴露侧向股骨髁。使用镶嵌