式成形术收集器 (Smith&N印hew, Memphis, TN, USA)，在 CBPBHA-100 组和 CBPBHA-90 组的右侧侧向股骨髁与 左侧侧向股骨髁两者中分别钻凿4X3mm(直径X深度）骨缺损。根据分组通过按压配合 来插入由CBPBHA-100和CBPBHA-90复合物形成，并且匹配缺损的尺寸的植入物。在所有 手术程序之后，将兔保持在笼中，并且用定期实验室饮食供养。在植入后6周时收集膝，并 且储存在10%中性缓冲福尔马林中。用数字照相机记录总体检查。使用微型CT成像系统 (ZKKS-MCT-Sharp-III扫描器，Caskaisheng，CHINA)进行计算机断层摄影术分析。将扫描 系统设置成70kV、30W和429 μ A。目标体积规定为植入物周围的骨组织，其包括自植入物 的纵轴开始延伸8_的整个小梁区室。植入物骨整合的程度通常由它的骨与植入物接触 (BIC)测量结果反映。基于微型CT图像，BIC被计算为历经总植入物周界所新形成的骨长 度的百分比。
[0165] 对于组织学分析，将石蜡包埋的脱钙组织切割成4 μ m切片，其接着被脱石蜡，水 化，并且用苏木精-曙红（H&E)染色。对于免疫组织化学染色，通过一系列等级的醇将石 蜡包埋的切片脱石蜡并水化。内源性过氧化物酶活性用含0.3%过氧化氢的PBS阻断。接 着用牛血清白蛋白（1:100稀释度）阻断切片，并且在4°C下与CD68和CD163的初级抗体 (Auragene，Changsha，China，1:50稀释度）一起孵育过夜。切片用PBS洗涤三次，并且与二 级抗小鼠 IgG -起在37°C下孵育1小时。在DAB溶液中显色，并且用苏木精复染。由两名 个别病理学家以盲法以及随机化方式根据H&E染色的切片和IHC染色来评估植入物周围的 炎症性反应。在割腱术后1周，自大鼠的跟腱的愈合中组织收集阳性对照组的来源，所述愈 合中组织的特征已在于起炎症性反应。针对⑶163和⑶68进行IHC染色以检测巨噬细胞。 在核被苏木精染色的细胞中，巨噬细胞看起来是棕色的。
[0166] 实施例9
[0167] 抑制癌生长的方法
[0168] 如下执行根据本文所述的一些实施方案的抑制癌生长的方法。首先，探宄柠檬 酸盐对细胞增殖的影响。在由补充有10% FBS和I %青霉素/链霉素的杜贝卡氏改良依 格氏培养基（DMEM)组成的生长培养基中培养人间质干细胞（hMSC) (Lonza Walkersville Inc.，USA)，接着在80-90%汇合之后在IO4个细胞/毫升的密度下接种于96孔板中。在调 整pH至7. 4之后，添加以柠檬酸形式计算的体积的柠檬酸盐至生长培养基中以获得生长培 养基中最终柠檬酸盐浓度 20 μ Μ、200 μ Μ、400 μ Μ、800 μ M、1000 μ Μ、2000 μ M、10, 000 μ M 或 20, 000 μ Μ。在37°C下在5% CO2下用补充有柠檬酸盐的培养基孵育hMSC。每隔一天更换培 养基。在预定时间点（添加梓檬酸盐后1天、4天和7天）时，遵循制造商方案（Sigma, USA)， 通过MTT (溴化甲基噻唑基二苯基-四唑鑰）测定来测定hMSC的增殖。在37°C下于MTT工 作溶液中孵育4小时之后，在黑暗条件下在轨道振荡器上使hMSC于96孔板中浸没在二甲 亚砜（DMSO)中15分钟。接着将96孔板放置在微板读取器上以获得在595nm下的吸光度 值。此外，在预定时间点（1天、4天和7天）时进行活/死染色。hMSC用活/死工作溶液 (Life Technologies Inc.，USA)染色30分钟，接着在Nikon倒置荧光显微镜下观察以测定 细胞活力。结果显示于图14和15中。如图14和15所指示，发现柠檬酸盐在20-2000 μM 的浓度窗中不影响hMSC增殖，但在更高浓度（高于2000 μ M并且多达20, 000 μ Μ)下遏制 hMSC增殖。
[0169] 在另一实验中，在柠檬酸盐存在下培养hMSC和骨肉瘤细胞（Saos-2细胞）（ATCC Inc.，USA)。如上所述培养hMSC。在补充有10% FBS和1 %青霉素/链霉素的麦考伊氏5A 培养基（McCoy' s 5A medium) (Lonza Walkersville Inc. ,USA)中培养 Saos-2 细胞。在 80-90 %汇合之后，在IO4个细胞/毫升的密度下将hMSC与Saos-2细胞两者接种于96孔 板中。在调整pH至7. 4之后，添加以柠檬酸形式计算的体积的柠檬酸盐至生长培养基中 以获得生长培养基中最终柠檬酸盐浓度20 μ M、200 μ Μ、400 μ Μ、800 μ M、1000 μ M、2000 μ M、 10, 000 μΜ或20, 000 μΜ。在37°C下在5% CO2下用补充有柠檬酸盐的培养基孵育hMSC和 Saos-2细胞。每隔一天更换培养基。在预定时间点（添加柠檬酸盐后1天和4天）时，如 上所述测定hMSC和Saos-2细胞的增殖。结果显示于图15和16中。如图15和16中所指 示，发现柠檬酸盐在高于800 μ M的浓度下抑制Saos-2细胞增殖。此外，在高于2000 μ M的 浓度下，大多数Saos-2细胞被杀死。
[0170] 已为了实现本发明的各种目标而描述本发明的各种实施方案。应认识到这些实施 方案仅说明本发明的原理。在不脱离本发明的精神和范围下，其众多修改和改适将易于为 本领域技术人员显而易知。
【主权项】
1. 一种促进骨生长的方法，其包括： 向骨细胞群体提供巧樣酸递呈组合物， 其中W所述组合物的体积计，所述巧樣酸递呈组合物提供在约20yM与约2000yM之 间的巧樣酸盐浓度。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述巧樣酸递呈组合物促进所述骨细胞群体中的细 胞分化和/或表型进展。3. 如权利要求2所述的方法，其中在所选细胞发育的第一阶段向所述骨细胞提供所述 巧樣酸递呈组合物W获得第一细胞分化或表型进展。4. 如权利要求3所述的方法，其中在所选细胞发育的第二阶段向所述骨细胞进一步提 供第二巧樣酸递呈组合物W获得第二细胞分化或表型进展。5. 如权利要求1所述的方法，其中所述巧樣酸递呈组合物促进所述骨细胞群体中的成 骨细胞表型进展。6. 如权利要求1所述的方法，其中所述巧樣酸递呈组合物至少部分抑制所述骨细胞群 体之中存在的癌细胞的生长。7. 如权利要求1所述的方法，其中所述骨细胞包括干细胞。8. 如权利要求1所述的方法，其中所述骨细胞在体外。9. 如权利要求1所述的方法，其中所述骨细胞在体内。10. 如权利要求1所述的方法，其中所述巧樣酸递呈组合物包含巧樣酸、或巧樣酸盐水 溶液。11. 如权利要求1所述的方法，其中所述巧樣酸递呈组合物包含含有巧樣酸部分的聚 合物或寡聚物。12. 如权利要求11所述的方法，其进一步包括通过降解所述聚合物或寡聚物来自所述 聚合物或寡聚物释放巧樣酸盐。13. 如权利要求12所述的方法，其中降解所述聚合物或寡聚物包括水解所述聚合物或 寡聚物的醋键。14. 如权利要求11所述的方法，其中所述巧樣酸递呈组合物包含具有式（I)结构的聚 合物或寡聚物：其中 Ri是-H、-OC(0)NHvA/w'或八~V'; v/VW^代表具有式（I)结构的重复单元的另一链；并且m、n、P和q独立地是在2至20的范围内的整数。15. 如权利要求11所述的方法，其中所述巧樣酸递呈组合物包含具有式（II)结构的聚 合物或寡聚物：(II)， 其中 尺2是-H或~W; 代表具有式（II)结构的重复单元的另一链；并且m、n和P独立地是在2至20的范围内的整数。16. 如权利要求11所述的方法，其中所述巧樣酸递呈组合物包含： 具有式（I)结构的第一聚合物或寡聚物：(I)， 其中 Ri是-H、-0C(0)NHww'或ww'; 代表具有式（I)结构的重复单元的另一链；并且m、n、P和q独立地是在2至20的范围内的整数；W及 具有式（II)结构的第二聚合物或寡聚物：(II)， 其中 尺2是-H或~w; 代表具有式（II)结构的重复单元的另一链；并且m、n和P独立地是在2至20的范围内的整数，并且 其中所述第一聚合物或寡聚物与所述第二聚合物或寡聚物渗合。17. 如权利要求11所述的方法，其进一步包括向所述骨细胞提供生物因子。18. 如权利要求17所述的方法，其中所述生物因子包括骨形态发生蛋白。19. 一种组合物，其包含； 具有式（I)结构的第一聚合物或寡聚物：(I) ， 其中 Ri是-H、-〇C做NHv/vw'或 代表具有式（I)结构的重复单元的另一链；并且m、n、P和q独立地是在2至20的范围内的整数；W及 具有式（II)结构的第二聚合物或寡聚物：(II) ， 其中 尺2是-H或~W; ww>代表具有式（II)结构的重复单元的另一链；并且m、n和P独立地是在2至20的范围内的整数，并且 其中所述第一聚合物或寡聚物与所述第二聚合物或寡聚物渗合。20. 如权利要求19所述的组合物，其中所述第一聚合物或寡聚物与所述第二聚合物或 寡聚物的重量比在约10:1与约1:10之间。21. 如权利要求19所述的组合物，其中所述第一聚合物或寡聚物和所述第二聚合物或 寡聚物彼此交联W形成聚合物网状结构。22. 如权利要求21所述的组合物，其进一步包含分散在所述聚合物网状结构中的颗粒 材料。23. 如权利要求22所述的组合物，其中所述颗粒材料包括哲磯灰石、磯酸=巧、双相磯 酸巧、生物玻璃、陶瓷、儀粉、儀合金和脱细胞骨组织粒子中的一个或多个。24. 如权利要求23所述的组合物，其中所述组合物包含多达约65重量％哲磯灰石。25. 如权利要求24所述的组合物，其中所述哲磯灰石由所述聚合物网状结构的一个或 多个侧挂官能团馨合。26. 如权利要求21所述的组合物，其进一步包含粘着于所述聚合物网状结构的骨组 织。27. 如权利要求26所述的组合物，其中所述骨组织围绕所述聚合物网状结构，并且所 述聚合物网状结构整合至所述骨组织中。28. 如权利要求27所述的组合物，其中所述组合物展现至少约80%的骨与植入物接 触。29. -种促进骨生长的方法，其包括将如权利要求19至25中任一项所述的组合物安置 在生物环境中。30. 如权利要求29所述的方法，其中促进骨生长包括上调osterix基因表达和/或碱 性磯酸酶基因表达。31. -种抑制癌的方法，其包括将如权利要求19至25中任一项所述的组合物安置在生 物环境中。
【专利摘要】在一个方面，本文描述促进骨生长的方法。在一些实施方案中，本文所述的促进骨生长的方法包括通过向骨细胞群体提供柠檬酸递呈组合物来促进所述骨细胞群体中的细胞分化或表型进展。在一些实施方案中，在所选细胞发育的第一阶段向骨细胞提供柠檬酸递呈组合物以获得第一细胞分化或表型进展。另外，在一些情况下，在所选细胞发育的第二阶段向骨细胞进一步提供第二柠檬酸递呈组合物以获得第二细胞分化或表型进展。
【IPC分类】C12N5/077
【公开号】CN104937096
【申请号】CN201480003896
【发明人】杨健
【申请人】德克萨斯系统大学董事会
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2014年1月2日
【公告号】CA2896587A1, EP2941482A1, US20140193356, WO2014107501A1