发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于由气态原料产生脂质的方法。所述方法包括一种用于由气态 原料产生一种或多种脂质产物的两阶段系统。
[0002] 发明背景
[0003] 全球能源危机引起了对于燃料生产替代方法的不断关注。运输用的生物燃料是汽 油的有吸引力的替代物并且作为低浓度共混物快速进入燃料市场。源自生物质的生物燃料 生产已作为一种增加替代能源生产和减少温室气体排放的主要方法而出现。已证明由生物 质生产生物燃料能使能源独立，从而促进农村地区的发展及经济的可持续发展。
[0004] 第一代液体生物燃料利用碳水化合物原料，如淀粉、蔗糖、玉米、油菜籽、大豆、棕 榈及植物油。第一代原料提出了许多重大的挑战。这些碳水化合物原料的成本受其作为人 类食品或动物饲料的价值的影响，而用于乙醇生产的淀粉或蔗糖生产作物的耕种并不是在 所有地理区域中都是经济可持续的。这些原料作为生物燃料来源的持续使用将不可避免地 对耕地和水资源带来极大的压力。因此，感兴趣的是开发将成本较低和/或更丰富的碳资 源转变成燃料的技术。
[0005] 第二代生物燃料是那些由纤维素和藻类产生的。藻类之所以被选择用来生产脂质 归于其快速的生长速率和藻类消耗二氧化碳及产生氧气的能力。
[0006] 已发现活跃的一个领域是脂质的微生物合成，其包括生物燃料生产所需的原材 料。大量的研宄已证明能够通过在不同的底物如工业用甘油、乙酸、污泥、乳清渗透物、甘蔗 糖蜜及稻草水解物上使用产油酵母而积聚脂质。同时，这些第二代生物燃料技术由于高生 产成本以及运输和原料储存成本而遇到了一些问题。
[0007] 早已认识到催化过程可用于将由C0、CO2或氢气（H2)组成的气体转化为多种燃料 和化学品。然而，微生物也可用于将这些气体转化为燃料和化学品。虽然这些生物过程通 常比热化学过程要慢，但与催化过程相比具有若干优点，包括更高的特异性、更高的产率、 更低的能源成本以及更大的抗中毒能力。
[0008] 通过一氧化碳和/或氢气及二氧化碳的厌氧发酵来产生乙酸（acetic acid)、 醋酸（acetate)及其它产物如乙醇已得到了论证。参见，例如Balch等人，（1977) International Journal of Systemic Bacteriology.，27:355-361 ;Vega 等人，（1989) Biotech. Bioeng.，34:785-793 ;Klasson 等人（1990)Appl. Biochem. Biotech.，24/25:1 ;等 等。
[0009] 已论证，产乙酸细菌，如来自醋酸杆菌属、穆尔氏菌属（Moorela)、梭状芽孢杆菌 属、瘤胃球菌属、醋酸杆菌属、真杆菌属、丁酸杆菌属、产醋杆菌属（Oxobacter)、甲烧八叠 球菌属、甲烷八叠球菌属及脱硫肠状菌属的那些，利用包含H 2、0)2和/或CO的底物并且 通过Wood-Ljungdahl途径（其中乙酰辅酶A合酶是关键酶）将这些气态底物转化为乙 酸、乙醇及其它发酵产物。举例来说，由气体产生乙酸和乙醇的杨氏梭菌（Clostridium ljungdahli)的各种菌株描述于 WO 00/68407、EP 117309、美国专利号 5, 173, 429、 5, 593, 886 和 6, 368, 819、WO 98/00558 和 WO 02/08438 中。已知细菌醇梭菌菌种 (Clostridium autoethanogenum sp)也由气体产生乙酸和乙醇（Aribini 等人，Archives of Microbiology 161，第 345-351 页（1994))。
[0010] 在约30°C的温度下生长良好的伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodi)( -种严 格厌氧的非孢子形成微生物）显示由&和0)2产生乙酸。Balch等人首先公开了细菌伍氏 醋酸杆菌，其通过氢气的厌氧氧化和二氧化碳的还原来生长。Buschorn等人证明了乙醇通 过伍氏醋酸杆菌在葡萄糖上的产生和利用。伍氏醋酸杆菌的发酵在高达20mM的葡萄糖（果 糖）浓度下进行。Buschorn等人发现当葡萄糖浓度增加到40mM时，在伍氏醋酸杆菌进入稳 定生长期时几乎一半的底物被保留，且乙醇作为另外一种发酵产物出现。Balch等人发现， 通过由伍氏醋酸杆菌进行的HjPCO 2的发酵所检测的仅有的主要产物是根据以下化学计量 的乙酸：4H2+2C02->CH 3C00H+H20。
[0011] 乙酸可能是不合需要的发酵产物，因为它是从含水发酵肉汤中回收的具有挑战性 的产物，其商业用途有限。
[0012] 本发明的一个目标是提供一种通过至少某种方式克服以上缺点的方法和发酵系 统，或至少向公众提供一种有用的选择。
【发明内容】
[0013] 第一方面，提供一种用于由气态底物产生至少一种脂质产物的方法，所述方法包 括：
[0014] a)在含有至少一种微生物的培养物的第一生物反应器中接纳所述气态底物，并发 酵所述气态底物以产生选自至少一种酸或至少一种酸和至少一种醇的产物；以及
[0015] b)将所述产物的至少一部分传送到包含至少一种微藻类的培养物的第二生物反 应器，并发酵所述酸以产生至少一种脂质产物。
[0016] 在一个实施方案中，气态底物包含CO或0)2和H2、或其混合物。在某些实施方案 中，气态底物源自于工业来源。在某些实施方案中，将来自至少一个工业来源的至少一种气 体共混以提供具有所期望的组成的气态底物。
[0017] 在一个实施方案中，所述一种或多种酸选自由以下组成的组：乙酸、丁酸、琥珀酸、 乳酸或丙酸。
[0018] 在一个实施方案中，所述一种或多种醇选自包括以下的组：乙醇、丁醇、甲醇或丙 醇。
[0019] 在各种实施方案中，将在第一阶段产生的所有酸和/或醇转化为第二阶段中的脂 质。在各种实施方案中，回收第一阶段中产生的至少一部分酸和/或醇。
[0020] 第二方面，提供一种用于由包含CO或0)2和H2或其混合物的气态底物中产生至少 一种脂质产物的方法，所述方法包括：
[0021] a)在包含至少一种微生物的培养物的初级生物反应器中接纳所述气态底物，并发 酵所述气态底物以产生至少一种酸；以及
[0022] b)将所述至少一种酸的至少一部分传送到包含至少一种微藻类的培养物的次级 生物反应器，并发酵所述至少一种酸以产生至少一种脂质产物。
[0023] 在一个实施方案中，所述至少一种酸是乙酸且所述至少一种微生物选自由以 下组成的组：醋酸杆菌属、穆尔氏菌属、梭状芽孢杆菌属、热球菌属、真杆菌属、脱硫细 菌属、氧化碳嗜热菌属（Carboxydothermus)、产醋菌属（Acetogenium)、厌氧醋菌属 (Acetoanaerobium)、丁酸杆菌属、消化链球菌属、瘤胃球菌属、产醋杆菌属以及甲烧八叠球 菌属。
[0024] 本领域技术人员将理解，包括pH范围的发酵条件是成功发酵包含CO或0)2和H 2 或其混合物的气态底物所必需的。发明人认识到可根据本发明使用的任何具体的产乙酸微 生物将具有最佳的pH范围，通常在pH 4与pH 8之间。在本发明的一个实施方案中，初级 生物反应器中的发酵pH维持在约pH 4. 5至约pH 6之间。在一个优选实施方案中，pH维 持在pH 5. 5。
[0025] 在一个实施方案中，在第二反应器中产生的脂质被用于产生至少一种三级产物。 在一个实施方案中，所述一种或多种三级产物选自包括以下的组：生物柴油、氢化来源的可 再生柴油（HDRD)、脂肪酸甲酯（FAME)及脂肪酸乙酯（FAEE)。
[0026] 第三方面，提供一种用于通过厌氧微生物发酵产生至少一种产物的方法，所述方 法包括：
[0027] a)将包含CO或0)2和H 2或其混合物的底物接纳至含有至少一种微生物的培养物 的第一初级生物反应器，所述微生物选自由以下组成的组：醋酸杆菌属、穆尔氏菌属、梭状 芽孢杆菌属、瘤胃球菌属、真杆菌属、丁酸杆菌属、产醋杆菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷八叠 球菌属及脱硫肠状菌属，并厌氧发酵所述底物以产生包含乙酸的发酵肉汤；
[0028] b)将所述发酵肉汤送入含有至少一种微藻类的培养物的次级生物反应器中；以 及
[0029] c)对乙酸进行发酵以产生至少一种脂质产物。
[0030] 在一个实施方案中，至少一部分所述发酵肉汤作为肉汤排放物（broth bleed)从 初级生物反应器被传送到次级生物反应器。
[0031] 在一个实施方案中，在初级生物反应器中产生的产物作为渗透物排放物被除去。
[0032] 在一个实施方案中，肉汤排放物和渗透物排放物在被送入次级生物反应器之前合 并。
[0033] 在一个实施方案中，合并的发酵肉汤被加工以便在料流被送入次级生物反应器之 前除去至少一部分乙酸。
[0034] 第四方面，提供一种用于控制发酵过程中的pH的方法，所述方法包括：
[0035] a)在第一生物反应器中接纳气态底物，所属第一生物反应器含有在液体营养培养 基中的至少一种微生物的培养物，并发酵所述气态底物以产生选自至少一种酸或至少一种 酸和至少一种醇的产物；
[0036] b)将所述产物的至少一部分传送到第二生物反应器，所述第二生物反应器包含在 液体营养培养基中的至少一种微藻类的培养物，并发酵所述至少一种酸以产生至少一种脂 质产物；以及
[0037] c)使至少一部分肉汤再循环回到第一生物反应器，其中再循环肉汤中的酸浓度大 幅降低。
[0038] 应当理解，以下实施方案可应用于如上所述的任何一个方面。
[0039] 在一个实施方案中，在被送入次级生物反应器之前，合并的发酵料流的pH被调节 至pH 6与pH 8之间。
[0040] 在各种实施方案中，次级生物反应器中的脂质生产可通过限制培养基中的至少一 种营养素来增加。在一个实施方案中，次级生物反应器中的脂质生产通过限制氮在培养基 中的量而增加。
[0041] 在本发明的一个实施方案中，次级生物反应器中的发酵肉汤中的乙酸与氮的比 率是至少10:1。在一个实施方案中，次级生物反应器的发酵肉汤中的乙酸与氮的比率是 49:1。在本发明的一个实施方案中，离开第一生物反应器的酸料流被处理以提供将被传送 到第二生物反应器的纯化的或浓缩的酸料流。在本发明的一个实施方案中，监测第二生物 反应器中的发酵肉汤的碳：氮比率，并且调节到生物反应器中的碳和氮的输入以确保大于 49:1的碳：氮比率。
[0042] 在本发明的一个实施方案中，初级生物反应器中产生的乙酸具有至少约5g/L或 至少约l〇g/L、或至少约15g/L或至少约20g/L的浓度。
[0043] 在本发明的一个实施方案中，初级生物反应器中乙酸的产生速率是至少约10g/L/ 天、或至少15g/L/天、或20g/L/天或至少约40g/L/天、或至少约60g/L/天。
[0044] 在本发明的一个实施方案中，微藻类选自包括以下的组：小球藻属、衣藻属、杜 氏藻属、裸藻属、金藻属、扁藻属、紫球藻属、螺旋藻属、蓝藻属（Synechoccus)、项圈藻 属、裂壶藻属（Schizochytrium)、Botyrococcus、墨角藻属、拟小球藻属、伪小球藻属、 Brateococcus、无绿藻属（Prototheca)以及栅列藻属（Scenedesmus)。
[0045] 在本发明的一个实施方案中，在次级生物反应器中的培养物的pH维持在约pH 6 至约pH 8之间。在一个优选实施方案中，pH维持在pH 7。
[0046] 在本发明的一个实施方案中，次级生物反应器中的pH与初级生物反应器中的pH 基本上相同。在替代实施方案中，离开初级生物反应器的料流在被送入次级生物反应器之 前，其pH被调节至约pH 7。
[0047] 在本发明的一个实施方案中，第二生物反应器中的脂质浓度是至少约10g/L或至 少约20g/L、或至少约40g/L、或至少约60g/L、或至少约80g/L、或至少约100g/L、或至少约 150g/L。在本发明的一个实施方案中，第二生物反应器中的脂质产生速率是至少约5g/L/ 天、或至少约7g/L/天、或至少约10g/L/天、或约15/g/L/天、或至少约20g/L/天、或至少 约 30g/L/ 天。
[0048] 在本发明的一个实施方案中，所述方法是