瓶中并且保存在冰箱中备用。
[0158] 采样和分析工序：
[0159] 培养基样品是在30天期间内在一定时间间隔下采集。
[0160] 所有样品都被用于确定在600nm下的吸光率（分光光度计）以及底物和产物的水 平（GC或HPLC)。HPLC常规地用于定量乙酸水平。
[0161] HPLC :HPLC System Agilent 1100 系列。流动相：0· 0025N 硫酸。流量和压力： 0.80011117111丨11。柱411七6(*1(^;目录号#9648，150\6.5111111，粒度5 4111。柱的温度：60°〇。 检测器：Refractive Index。检测器的温度：45°C。
[0162] 用于样品制备的方法：将400 μ L的样品和50 μ L的0. 15M ZnSOdP 50 μ L的0. 15M Ba(0H)2装入Eppendorf试管中。将试管在 12,000rpm、4°C下离心10min。将 200 μL上清 液转移到HPLC小瓶中，并且将5 μ L注射到HPLC仪器中。
[0163] 顶空分析：测量是在具有两个安装通道的Varian CP-4900微型GC上进行。通道1 是在70°C、200kPa氩气和4. 2秒的反冲时间下运行的IOm Mol-筛柱，而通道2是在90°C、 150kPa氦气和没有反冲下运行的IOm PPQ柱。两个通道的注射器温度是70°C。运行时 间被设定为120秒，但所关注的所有峰通常将在100秒之前洗脱。发酵罐的顶部空间通过 Gas-GC(Varian 4900 Micro-GC)每小时自动地分析。
[0164] 细胞密度：通过计数发酵肉汤的限定等分试样中的细菌细胞来测定细胞密度。或 者，样品的吸光率是在600nm下测量（分光光度计）并且干燥质量根据公开的工序经由计 算来测定。
[0165] 实施例1 :C0在牛物反应器中的发酵以产牛乙酸:
[0166] 醇梭菌的甘油原料在血清瓶中复苏。将保存在80 °C的甘油原料缓慢解冻并使用注 射器将其转移到血清瓶中。此过程在厌氧箱内部进行。随后，将接种的血清瓶从厌氧箱中 移开并且使用含CO的气体混合物（40% C0、3% H2、21% C02、36% N2)加压到45psi的 总压力。然后将瓶子水平地置于在37°C的温度下的培养箱内的振动器上。培养两天之后 且检验到培养物生长之后，将瓶子用于接种另一组八个含气体的血清瓶，所述血清瓶具有 5mL的此培养物。如上所述，再将这些血清瓶培养一天，然后用于接种5L在IOL CSTR中制 备的液体培养基。初始的含CO的气体流量被设定在100~mL/min且搅拌速度被设定在低 的200rpm。当微生物开始消耗气体时，将搅动和气体流量增加到400rpm和550mL/min。以 分批模式生长两天之后，发酵罐转为以0.25 1/天的稀释率连续进行。稀释率提高了 0.25 1/天，达到每24小时1 1/天的值。
[0167] 代谢物和微生物生长可见于图3中。反应器中载运的乙酸浓度为约10g/L至高于 20g/L。稀释率为1.0。乙酸的生产率为10g/L/天至高于20g/L/天。乙酸与乙醇的比率在 约5:1至约18:1之间变化。
[0168] 实施例2 :C02和H2在牛物反应器中的发酵以产牛乙酸：
[0169] pH 6. 5的培养基使用由Balch等人（参见，例如Balch等人，（1977) International Journal of Systemic Bacteriology. ,27:355-361)所定义的方案来制备。 三升反应器中填充有1500ml培养基。通过用N2连续地喷射将氧气从培养基中除去。在接 种之前30分钟将气体从N 2转换为60% H2、20% 〇)2及20% 1的混合物。接种物（150ml) 来自于用相同气体混合物喂饲的连续伍氏醋酸杆菌培养物。生物反应器维持在30°C下并且 在接种之时在200rpm下搅拌。在之后的分批生长期期间，将搅动逐渐地提高到600rpm。根 据因增加的生物质而在顶部空间中滴落的H 2/C02，气体流量逐渐地增加了 50ml/min。为了 补偿所产生的乙酸，使用5M NaOH将pH自动地控制至7。在整个发酵过程中，将0. 5M Na2S 溶液以〇.2ml/小时的速率泵送入发酵罐中。1天之后培养基成为连续的。为了达到高生物 质以及高气体消耗，必须将发酵罐中的乙酸浓度保持在低于20g/L的水平。这是通过在相 对较高的稀释率（D~1. 7/天）下运行发酵罐同时保留具有孔径大小为0. 1 μm的聚砜膜 过滤系统的发酵罐（GE healthcare hallow纤维膜）中的微生物来实现。用于连续培养的 培养基是排除了复合痕量金属溶液的溶液A，其通过使用自动注射泵以I. 5ml/小时的速率 被单独送入。在至少1天之前为培养基脱气且在整个发酵过程中进行连续脱气。
[0170] MM
[0171] 三十天后，产生浓度为12. 5g/L的乙酸。乙酸的平均生产率为每天21. 8g/L。
[0172] 乙酸在连续培养中的最大浓度是17. 76g/L(296mM)。
[0173] 实施例3微藻类乙酸利用
[0174] 最近已论证微藻类可利用乙酸作为碳源来产生脂质。Ren等人已证明在包含乙 酸作为碳源的液体培养基中培养的栅列藻种产生43. 4%的总脂质含量和1.86g Γ1的最 大生物质浓度（Ren，H·，Liu, B·，Ma, C·，Zhao, L·，Ren, N. "A new lipid-rich microalga Scenedesmus sp. strain R-16 isolated using Nile red staining:effects carbon and nitrogen sources and initial pH on the biomass and lipid production. Biotechnology for Biofuels，2013,6(143))〇
[0175] 在本系统中，源自于气态底物的厌氧发酵的乙酸被送入包含微藻类如栅列藻种的 CSTR。微藻类是在25°C和pH 7下在培养基中培养。搅动被设定在150rpm。氮源如硝酸钠 也应存在于培养基中，浓度在0. 1-1. 〇g/L范围内，这取决于乙酸浓度。一旦培养基中的所 有乙酸都被转化为生物质，便使用已知的提取法将脂质从生物质中提取出。
[0176] 本说明书中对任何现有技术的参考不被并不应被认为承认或以任何形式地建议 现有技术在任何国家形成所致力领域的公知常识的部分。
[0177] 除非上下文另外要求，否则在整个说明书和权利要求书中，单词"包括"、"包括" 等均被视为是与封闭含义相反的开放含义，也就是"包括但不限于"的意思。
【主权项】
1. 一种用于由气态底物产生至少一种脂质产物的方法，所述方法包括： a) 在第一生物反应器中接纳气态底物，所述第一生物反应器包含在液体营养培养基中 的至少一种微生物的培养物，并发酵所述气态底物以产生选自酸或酸和醇的产物；以及 b) 将酸产物的至少一部分传送到第二生物反应器，所述第二生物反应器包含在液体营 养培养基中的至少一种微藻类的培养物，并发酵所述酸以产生至少一种脂质产物。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物包含CO或CO 2和H 2、或其混合物。3. 如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种酸选自由以下组成的组：乙酸、丁酸、 琥珀酸、乳酸及丙酸。4. 如权利要求1所述的方法，其中所述酸是乙酸，并且乙酸在所述第一生物反应器中 的产生速率是至少l〇g/L/天。5. 如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种醇选自包括以下的组：乙醇、丁醇、甲 醇、丙醇及其混合物。6. 如权利要求1所述的方法，其中在所述第一生物反应器中的所述至少一种微生物选 自由以下组成的组：醋酸杆菌属、穆尔氏菌属、梭状芽孢杆菌属、热球菌属、真杆菌属、脱硫 细菌属、氧化碳嗜热菌属、产醋菌属、厌氧醋菌属、丁酸杆菌属、消化链球菌属、瘤胃球菌属、 广醋杆囷属以及甲火元八萱球囷属。7. 如权利要求1所述的方法，其中所述第二生物反应器中的所述至少一种微藻类选 自包括以下的组：小球藻属、衣藻属、杜氏藻属、裸藻属、金藻属、扁藻属、紫球藻属、螺旋 藻属、蓝藻属（Synechoccus)、项圈藻属、裂壶藻属（Schizochytrium)、Botyrococcus、墨 角藻属、拟小球藻属、伪小球藻属、Brateococcus、无绿藻属（Prototheca)以及栅列藻属 (Scenedesmus)〇8. 如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种脂质产物被用于产生选自由以下组成 的组的至少一种三级产物：氢化来源的可再生柴油（HDRD)、脂肪酸甲酯（FAME)、脂肪酸乙 酯（FAEE)及生物柴油。9. 如权利要求1所述的方法，其中脂质生产在所述第二生物反应器中通过基本上限制 在所述液体营养培养基中的至少一种营养素而增加。10. 如权利要求9所述的方法，其中所述限制性营养素是氮。11. 一种用于控制发酵过程中的pH的方法，所述方法包括： a) 将包含CO或0)2和H 2或其混合物的气态底物传送到第一生物反应器，所述第一生 物反应器包含在液体营养培养基中的至少一种微生物的培养物，并发酵所述气态底物以产 生包含选自至少一种酸或至少一种酸和至少一种醇的产物的肉汤； b) 将包含所述产物的所述肉汤的至少一部分传送到第二生物反应器，所述第二生物反 应器包含在液体营养培养基中的至少一种微藻类的培养物，并发酵所述酸以产生至少一种 脂质产物；以及 c) 使来自所述第二反应器的所述肉汤的至少一部分再循环回到所述第一生物反应器， 其中再循环肉汤中的酸浓度大幅降低。12. 如权利要求11所述的方法，其中所述第一生物反应器中的pH维持在pH 4. 5至6。13. 如权利要求11所述的方法，其中所述酸选自由以下组成的组：乙酸、丁酸、琥珀酸、 乳酸及丙酸。14. 如权利要求11所述的方法，其中所述酸是乙酸，并且其中乙酸在所述第一生物反 应器中的产生速率是至少l〇g/L/天。15. 如权利要求11所述的方法，其中所述至少一种醇选自由以下组成的组：乙醇、丁 醇、甲醇及丙醇。16. 如权利要求11所述的方法，其中在所述第一生物反应器中的所述至少一种微生物 选自由以下组成的组：醋酸杆菌属、穆尔氏菌属、梭状芽孢杆菌属、热球菌属、真杆菌属、脱 硫细菌属、氧化碳嗜热菌属、产醋菌属、厌氧醋菌属、丁酸杆菌属、消化链球菌属、瘤胃球菌 属、广醋杆囷属以及甲;)?八萱球囷属。17. 如权利要求11所述的方法，其中所述第二生物反应器中的所述至少一种微藻类 选自包括以下的组：小球藻属、衣藻属、杜氏藻属、裸藻属、金藻属、扁藻属、紫球藻属、螺旋 藻属、蓝藻属、项圈藻属、裂壶藻属、Botyrococcus、墨角藻属、拟小球藻属、伪小球藻属、 Brateococcus、无绿藻属以及栅列藻属。18. 如权利要求11所述的方法，其中所述至少一种脂质产物被用于产生选自包括以下 的组的至少一种三级产物：FAME、FAEE、HDRD及生物柴油。19. 如权利要求11所述的方法，其中脂质生产在所述第二生物反应器中通过基本上限 制在所述液体营养培养基中的至少一种营养素而增加。20. 如权利要求19所述的方法，其中所述限制性营养素是氮。21. 如权利要求11所述的方法，进一步包括首先处理来自步骤（c)的肉汤以除去基本 上所有的生物质，之后使所述肉汤再循环到所述第一生物反应器。22. 如权利要求11所述的方法，进一步包括首先使来自步骤（c)的肉汤穿过氧气洗涤 单元，之后使所述肉汤再循环到所述第一生物反应器。
【专利摘要】本发明提供使用两阶段发酵过程由气态底物产生脂质产物的方法和系统。所述方法包括向含有一种或多种微生物的培养物的第一生物反应器提供包含CO或CO2和H2或其混合物的气态底物，并发酵所述底物以产生乙酸。然后将来自所述第一生物反应器的乙酸提供给第二生物反应器，其中所述乙酸被用作通过一种或多种微藻类发酵成脂质的底物。
【IPC分类】C12P7/64
【公开号】CN104955956
【申请号】CN201380057205
【发明人】肖恩·丹尼斯·辛普森, 塞巴斯蒂安·米甲·贝尔纳谢克
【申请人】朗泽科技新西兰有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2013年11月29日
【公告号】EP2925874A1, US20140154755, WO2014085756A1