用于将甲烷转化成燃料、丙酮酸或异丁醇的无细胞系统的制作方法
【专利说明】用于将甲烷转化成燃料、丙酮酸或异丁醇的无细胞系统
[0001] 相关申请
[0002] 本申请根据35 U. S. C. § 119(e)要求于2012年12月21日提交的美国临时申请 U. S. S. N. 61/740, 972的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
【背景技术】
[0003] 异丁醇在碳水化合物发酵期间自然产生并且还可以是有机物质衰变过程的副 产物（渥美（Atsumi)等人2008自然（Nature)451:86_89)。首先在来自梭菌属（genus Clostridium)的细菌种类中发现了用于产生异丁醇的生物合成路径。这一路径已被基因工 程改造到比梭菌属的微生物更容易通过当前科学方法操作的若干种类微生物中（佩拉尔 塔-叶海亚（Peralta-Yahya) 2012 自然 488:320-328)。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种用于将天然气，尤其甲烷，转化成目标生物燃料（例如异丁醇）和 其它化合物的无细胞系统。天然气是主要为甲烷的烃气混合物，并且还包括不同量的其它 高级烷烃和较小百分比的二氧化碳、氮气以及硫化氢。本发明的方面独特地组合生物合成 和化学工程工艺以提供能够从天然气每升-小时生产大于例如IOg到25g生物燃料的无细 胞生物合成系统。举例来说，大小设定成使用155m 3反应器的工业或商业工厂每年（例如 >500ΒΗ)标度）可以产生大于30, 000公吨生物燃料（例如异丁醇），在一些情况下原料成 本小于产物价值的20%。
[0005] 本文所提供的无细胞工艺，在一些实施例中，将⑴表达将甲烷转化成甲醇 或甲醛的酶（例如甲烷单氧酶，MM0)的甲烷代谢甲烷氧化菌（例如巴斯荚膜甲基球菌 (Methylococcus capsulatus Bath))的无细胞裂解物与（ii)来自表达将甲醇或甲醛转化 成生物燃料或其它化合物的酶的重组细菌细胞（例如大肠杆菌）的无细胞裂解物组合。在 加压生物反应器（例如至少1巴）中将细胞裂解物与都是MMO活化所需的甲烷和氧气组合 以驱动甲烷转化成生物燃料或其它化合物。本发明的无细胞工艺典型地使用多相反应系 统，其尤其适用于通过首先将气体扩散到水相中来将甲烷和氧气递送到暴露的脂质双层薄 膜（例如细胞裂解物的细胞内膜囊泡）。在一些实施例中，向无细胞系统中外源添加将甲烷 转化成甲醛及/或将甲醛转化成生物燃料或其它化合物的酶。此类外源添加酶可以经纯化 或部分纯化。
[0006] 应理解，虽然本发明描述了甲烷氧化菌用于表达/生产将甲烷转化成甲醛的酶的 用途，但本文中涵盖供用于生产将甲烷转化成甲醛的酶的其它生物体。
[0007] 在一些方面中，本文提供了用于将甲烷大规模转化成生物燃料或其它化合物的无 细胞方法，其包含：在生物反应器中在高压下，将一或多种含有催化甲烷转化成甲醛的酶和 催化甲醛转化成生物燃料或另一种化合物的酶的细胞裂解物、甲烷以及氧气组合以形成无 细胞反应混合物；以及在适合的条件（例如高压，37°c)下培育无细胞反应物以将甲烷转化 成生物燃料或其它化合物。在一些实施例中，生物反应器可以进一步包含有机溶剂（例如 癸烷）。在一些实施例中，用甲烷使有机相饱和或过饱和。"适合的条件"包括（但不限于） 至少1巴（例如1巴到10巴或5巴到10巴）的压力和/或35°C到40°C (例如37°C )的 温度。
[0008] 在一些实施例中，本文提供了用于将甲烷大规模转化成异丁醇的无细胞方法，其 包含：在生物反应器中在高压下，将一或多种含有甲烷单氧酶和甲醇脱氢酶（例如重组NAD 连接型甲醇脱氢酶）（其催化甲烷转化成甲醛）以及己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷酸-3-己 酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核糖-5-磷 酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表异构酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸 变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、α -酮 异戊酸脱羧酶以及异丁醇脱氢酶中的一或多者（其催化甲醛转化成异丁醇）的细胞裂解 物、甲烷以及氧气组合以形成无细胞反应混合物；以及在适合的条件下培育无细胞反应物 以将甲烷转化成异丁醇。在一些实施例中，生物反应器可以进一步包含有机溶剂（例如癸 烷）。
[0009] 甲醛转化成生物燃料或其它化合物的中间产物中的一者是丙酮酸。因此，在一些 方面中，本文提供了用于将甲烷大规模转化成丙酮酸的无细胞方法，其包含：在生物反应 器中在高压下，将一或多种含有催化甲烷转化成甲醛的酶和催化甲醛转化成丙酮酸的酶的 细胞裂解物、甲烷以及氧气组合以形成无细胞反应混合物；以及在适合的条件下培育无细 胞反应物以将甲烷转化成丙酮酸。在一些实施例中，生物反应器可以进一步包含有机溶剂 (例如癸烷）。
[0010] 在一些实施例中，本文提供了用于将甲烷大规模转化成丙酮酸的无细胞方法，其 包含：在生物反应器中在高压下，将一或多种含有甲烷单氧酶和甲醇脱氢酶（例如重组NAD 连接型甲醇脱氢酶）（其催化甲烷转化成甲醛）以及己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷酸-3-己 酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核糖-5-磷 酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表异构酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸 变位酶、烯醇酶以及丙酮酸激酶中的一或多者（其催化甲醛转化成丙酮酸）的细胞裂解物、 甲烷以及氧气组合以形成无细胞反应混合物；以及在适合的条件下培育无细胞反应物以将 甲烷转化成丙酮酸。在一些实施例中，生物反应器可以进一步包含有机溶剂（例如癸烷）。 [0011] 在其它方面中，本文提供了用于将甲烷大规模转化成生物燃料或其它化合物的无 细胞系统和组合物，其包含生物反应器，所述生物反应器包含：气相，其包含甲烷和氧气； 以及水相，其包含含有催化甲烷转化成甲醛的酶和催化甲醛转化成生物燃料或化合物的酶 的细胞裂解物。在一些实施例中，生物反应器进一步包含有机相，所述有机相包含有机溶剂 (例如癸烷）。
[0012] 在一些实施例中，本文提供了用于将甲烷大规模转化成异丁醇的无细胞系统和组 合物，其包含生物反应器，所述生物反应器包含：气相，其包含甲烷和氧气；以及水相，其包 含一或多种含有甲烷单氧酶和甲醇脱氢酶（例如重组NAD连接型甲醇脱氢酶）（其催化甲 烷转化成甲醛）以及己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、 果糖二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表 异构酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、 乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、α -酮异戊酸脱羧酶以及异丁醇脱 氢酶（其催化甲醛转化成异丁醇）的细胞裂解物。在一些实施例中，生物反应器进一步包 含有机相，所述有机相包含有机溶剂（例如癸烷）。
[0013] 在一些实施例中，本文提供了用于将甲烷大规模转化成丙酮酸的无细胞系统和组 合物，其包含生物反应器，所述生物反应器包含：气相，其包含甲烷和氧气；以及水相，其包 含一或多种含有甲烷单氧酶和甲醇脱氢酶（例如重组NAD连接型甲醇脱氢酶）（其催化甲 烷转化成甲醛）以及己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、 果糖二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表 异构酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶以及丙酮酸激 酶（其催化甲醛转化成丙酮酸）的细胞裂解物。在一些实施例中，生物反应器进一步包含 有机相，所述有机相包含有机溶剂（例如癸烷）。
[0014] 在一些方面中，本文提供了用于将甲烷大规模转化成丙酮酸的无细胞方法，其包 含：（a)在甲烷氧化菌中表达一或多种将甲烷转化成甲醛的酶，（b)在重组细菌中表达一或 多种将甲醛转化成丙酮酸的酶，（c)将来自甲烷氧化菌和重组细菌的细胞裂解物与甲烷、有 机溶剂（例如癸烷）以及氧气组合以形成无细胞反应混合物，以及（d)在适合的条件下培 育无细胞反应物以将甲烷转化成丙酮酸。在一些实施例中，一或多种将甲烷转化成甲醛的 酶选自甲烷单氧酶和甲醇脱氢酶。在一些实施例中，一或多种将甲醛转化成丙酮酸的酶选 自己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩 酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表异构酶、甘油醛 3_磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶以及丙酮酸激酶。
[0015] 在一些实施例中，所述方法进一步包含使甲烷氧化菌和/或重组细菌细胞裂解 (例如在组合步骤之前）。
[0016] 在一些实施例中，所述方法进一步包含在重组细菌细胞中表达分解酶并且使其失 活的蛋白酶。举例来说，蛋白酶可以分解丙酮酸脱氢酶和/或甲醛脱氢酶并且使其失活。或 者，可以外源添加蛋白酶。
[0017] 本文还提供了包含一或多种将甲烷转化成甲醛的酶的细胞裂解物以及包含一或 多种将甲醛转化成生物燃料或其它化合物的酶的细胞裂解物。在一些实施例中，所述细胞 裂解物包含一或多种将甲醛转化成丙酮酸的酶或一或多种将甲醛转化成异丁醇的酶。细胞 裂解物可以进一步包含小分子和辅因子（例如三磷酸腺苷、NAD(PH))以及盐（如镁）以便 酶起作用。
[0018] 本文进一步提供了通过本文所描述的无细胞工艺中的任何一或多者产生的生物 燃料和其它化合物或中间物。
【附图说明】
[0019] 图1显示了经设计以将甲烷和氧气以较高速率递送到水相中的本发明的示例性 无细胞多相反应系统的图式。
[0020] 图2显示了本发明的示例性无细胞转化平台的图式。
[0021] 图3显示了本发明的示例性无细胞转化平台的图式。
[0022] 图4显示了异丁醇路径的图式。
[0023] 图5显示了甲烷单氧酶（MMO)催化系统的图式，其假定通过烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸（NAD+)偶合甲醇脱氢酶来供应足够的NADH。
[0024] 图6显示了供用于一些实施例中以评估气体/液体界面形成和稳定性的设备的图 式。
[0025] 图7显示了供用于一些实施例中以评估系统性能和安全性的设备的图式。
[0026] 图8显示了供用于评估MMO活性和甲烷氧化菌细胞生长的多路复用配备工具的反 应器的图式。
[0027] 图9显示了表明原料灵活性的图式。
[0028] 图10显示了表明单一提取可以接受葡萄糖或核糖-5-P的数据的曲线图。
[0029] 图11显示了表明5-碳（C5)和6-碳（C6)糖在无细胞反应中的用途的图式。
[0030] 图12显示了甲烷代谢的图式。
[0031] 图13显示了需要能量和还原等效物的异戊二烯路径的图式。
[0032] 图14显示了甲烷作为异戊二烯的唯一碳源的图式。
【具体实施方式】
[0033] 在一些实施例中，本文提供了用于将天然气，尤其甲烷，转化成生物燃料和其它化 合物的无细胞系统。所述工艺在典型地在高压力（例如至少1巴或至少5巴）下操作的反 应器中将来自甲烷氧化菌的无细胞裂解物与来自其它重组细菌的那些组合。本发明的无细 胞工艺、系统、反应混合物、组合物、重组生物体以及核酸构建体被视为实现从甲烷或天然 气有效生产许多不同生物燃料或其它化合物的平台技术的部分。使用无细胞生物合成系统 并不需要维持细胞活力，使得能够直接监测并且调节反应参数（例如底物进料速率、温度、 PH、压力、溶解氧），提供灵活的反应环境，并且使得能够控制碳和能量通量（参见例如国际[0034] 一般来说，本发明的无细胞工艺包括（i)使用甲烷氧化菌表达将甲烷转化成甲醛 的酶（例如MMO)，（ii)使用重组细菌（例如大肠杆菌）表达将在生物合成路径中产生生物 燃料和其它化合物的酶，以及（iii)使用具有灵活性的控制系统和反应环境（其先前仅通 过化学工艺使用无机催化剂提供）。
[0035] 本发明的一些方面提供无细胞工艺，其使用多相反应系统，如图1中所示。在一 些实施例中，无细胞