解。在 一些实施例中，一或多种酶表达并且任选地在细胞的细胞质中隔离，之后裂解。在一些实施 例中，一或多种酶表达并且任选地在周质空间中隔离。酶在周质空间中的隔离是所属领域 中已知的，参见例如PCT申请第PCT/US2011/035639号，其以引用的方式并入本文中。在提 供细胞裂解物的细胞裂解后，隔离酶自由地与裂解物或不同裂解物中还存在的一或多种底 物反应。
[0088] 甲烷到生物燃料和其它化合物的无细胞生物转化
[0089] 本文所提供的无细胞生物合成系统适用于从甲烷生产生物燃料或其它化合物 (例如丙酮酸）。举例来说，适用作第二代生物燃料的相对较高纯度（99%)的异丁醇可以 根据本发明由甲烷产生。异丁醇具有使其成为理想的汽油替代物的若干特性：其能量密度 是汽油的98 %，其不易于吸收水（不同于乙醇），从而避免引擎部件的腐蚀，并且其可以任 何比例与汽油组合，使其"投入"当前可燃的基础设施中。来源于天然气的异丁醇可以与常 规汽油组合用于快速商业化，或其可以用作油衍生燃料的完全替代物，取决于工艺和全球 油价的经济表现。
[0090] 催化甲烷转化成甲醛的酶包括（但不限于）甲烷单氧酶（将甲烷催化成甲醇）和 甲醇脱氢酶（将甲醇催化成甲醛）。在一些实施例中，甲烷单氧酶和甲醇脱氢酶提供于一 或多种获自甲烷氧化菌的细胞裂解物中。在其它实施例中，甲烷单氧酶提供于获自甲烷氧 化菌的细胞裂解物中，同时甲醇脱氢酶提供于来自例如大肠杆菌的重组细菌的细胞裂解物 中。本发明还涵盖以例如经纯化或部分纯化形式外源提供甲烷单氧酶和/或甲醇脱氢酶。
[0091] 催化甲醛转化成丙酮酸的酶包括（但不限于）己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷 酸-3-己酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核 糖-5-磷酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表异构酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷 酸甘油酸变位酶、烯醇酶以及丙酮酸激酶。
[0092] 催化丙酮酸转化成异丁醇的酶包括（但不限于）乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸异构 还原酶、二羟酸脱水酶、α -酮异戊酸脱羧酶以及异丁醇脱氢酶。
[0093] 根据本发明使用的酶显示于表1中。
[0094] 表1
[0095]
[0097] 应理解，本文所提供的酶中的任何一或多者可以用于本发明的无细胞生物合成工 艺的任何一或多种细胞裂解物中。本发明还涵盖使用一或多种细胞裂解物，其各自含有例 如将底物（例如甲烷）转化成产物（例如异丁醇）或产物中间物（例如甲醛或丙酮酸）的 酶的不同组合。
[0098] 根据本发明的甲烷到异丁醇的无细胞转化的生物合成路径的一个实例描绘于图5 中。组合来自至少两种不同细菌细胞（包括甲烷氧化菌（例如巴斯荚膜甲基球菌）的细胞 提取物的本文所提供的无细胞途径使得与用甲烷转化成生物燃料必需的所有酶工程改造 单一有机体相关的问题最小化。尽管如此，在一些实施例中，可以使用单一有机体来表达甲 烷转化成生物燃料或其它化合物必需的所有酶。在图5中所描绘的实例中，使用来自巴斯 荚膜甲基球菌和大肠杆菌细胞的细胞裂解物。通过甲烷氧化菌的裂解物中所提供的甲烷单 氧酶（MMO)催化甲烷转化成甲醇的第一步骤。通过异源（例如来自不同物质）NAD连接型 甲醇脱氢酶（例如来自甲醇芽孢杆菌（Bacillus methanolicus),德弗里斯GE(de Vries GE),等人1992细菌学杂志（J Bacteriol 174:5346-53)，其以引用的方式并入本文中）（其 替代产自甲烷氧化菌的甲醇脱氢酶）催化甲醇转化成甲醛的第二步骤。这一 NAD连接型甲 醇脱氢酶为甲烷单氧酶提供必需NADH还原剂，导致甲烷到甲醛的转化的电子的净零消耗。 因此，在一些实施例中，本发明的无细胞系统的甲烷氧化菌可以表达甲烷单氧酶和外源性 或重组 NAD连接型甲醇脱氢酶。
[0099] 在天然甲烷氧化菌代谢过程中，甲醛进一步被甲醛脱氢酶氧化成甲酸，随后氧化 成〇)2从而为甲烷氧化菌细胞功能产生能量。这在使用完整甲烷氧化菌用于生物生产方面 是一种限制。因为典型地在本发明的无细胞工艺中仅使用来自甲烷氧化菌的MMO和甲醇脱 氢酶，在一些实施例中，可以在不影响甲烷氧化菌功能的情况下通过靶向甲醛脱氢酶以便 被重组细菌（例如大肠杆菌）细胞中表达的蛋白酶分解而省略这一碳途径。
[0100] 在一些实施例中，NAD连接型甲醇脱氢酶不在甲烷氧化菌中而是在另一种细菌细 胞（如大肠杆菌）中表达，如本文所论述。
[0101] 通过提供于另一种重组细胞（例如大肠杆菌）的提取物中的酶催化甲醛转化成异 丁醇的图5中所描绘的额外步骤。两种核酮糖单磷酸循环酶（己酮糖-6-磷酸合成酶和 6_磷酸-3-己酮糖异构酶）以及酮异戊酸脱羧酶和异丁醇氧化还原酶在细胞中过度表达， 这是丙酮酸转化成异丁醇所需的。除省略甲醛进一步氧化成〇) 2外，在某些实施例中还可 以使用蛋白酶靶向方法通过靶向丙酮酸脱氢酶以便被蛋白酶分解来消除丙酮酸到其他分 子的通量。因此，在一些实施例中，本发明的无细胞系统的重组细菌可以表达己酮糖-6-磷 酸合成酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、酮异戊酸脱羧酶以及异丁醇氧化还原酶中的任何一 或多者。在一些实施例中，重组细菌还可以表达靶向经工程改造的甲醛脱氢酶和/或丙酮 酸脱氢酶的蛋白酶。在一些实施例中，可以外源添加蛋白酶。
[0102] 在一些实施例中，将甲烷和氧气递送到甲烷单氧酶可以通过首先使气体扩散到水 相中来实现。通过去除活细胞中必须穿越的细胞壁阻障层，本文所提供的无细胞工艺简化 了质量转移过程。在一个实施例中，将气体单独馈入反应器中以避免气体混合直到其已进 入水相为止，从而避免了与自燃相关的问题。稳定多相系统的一个实例描绘于图1中。这 一图式包括癸烷相，其用于帮助递送甲烷并且在产生异丁醇时吸收异丁醇。在癸烷相进入 无细胞反应器之前，将甲烷的较小气泡引入癸烷相中。甲烷在癸烷中比在水中具有高得多 的溶解性，因此与水相接触的癸烷表面区域有助于将甲烷扩散到水相中。尽管如此，在一些 实施例中，一些甲烷气体被直接注入水相中。
[0103] 为了评估气体/液体和液体/液体界面的形成和稳定性，例如，甲烷气泡的形成和 稳定性，在一些实施例中可以使用图7中所描绘的设备。当甲烷流过注入喷嘴时，甲烷可以 注入细胞提取物溶液中。初始高速摄像机准许精确测量所形成的气泡的尺寸和均匀性。这 一流体随后传送到保持回路中，并且在设定间隔后，通过第二高速摄像机进行监测以测量 气泡稳定性。在一些实施例中，气泡形成后的培育时间通过改变保持回路尺寸和/或流动 速率来调节。图7中所描绘的设备还可以用于检验喷嘴设计和注入压力的影响以及多种喷 嘴对气泡尺寸和稳定性的影响。
[0104] 在一些实施例中，脂肪酸和/或表面活性剂用于帮助形成气体/液体界面并且使 其稳定。在不受理论束缚的情况下，脂肪酸的疏水性尾部和亲水性羧酸头部使其在气体/ 液体界面处聚集以使界面稳定。
[0105] 在一些实施例中，所产生的甲烷气泡直径小于3 μπι到7 μπι。举例来说，所产生的 甲烷气泡直径可能小于3以111、4以111、5以111、6以111或7以111。在一些实施例中，在初始气泡形成 后，甲烷气泡直径保持小于8 μ m到12 μ m持续一段时间。举例来说，在初始气泡形成后，甲 烷气泡保持小于8μπ?、9μπ?、10μπ?、11 μL?或12μπ?持续至少一分钟、两分钟、三分钟、四分 钟或五分钟。
[0106] 此外，图7中所描绘的设备可以用于研宄癸烷泡沫中的甲烷的形成和稳定性以及 图1中图示的乳液的形成。如上文所论述，表面活性剂可以用于帮助形成所需界面并且使 其稳定，所述界面界定癸烷相中的甲烷气泡以及无细胞反应器乳液中的癸烷液滴。
[0107] 为了评估本发明的无细胞生物转化工艺的安全性和生产率，在一些实施例中可以 使用图8中示出的设备。这一反应器准许分开调节甲烷和空气注入速率以及压力。这些容 器典型地较小，工作体积为10到100mL，其有助于保存提取物并且使安全风险减到最少。控 制背压并且监测温度和溶解氧。冷却/加热回路未显示于图8中所描绘的反应器中。此类 反应器可以是绝热的以准许通过监测冷却/加热流体的流动速率和温度升高（或降低）来 计算热平衡。此外，可以记录进入气体流动速率并且可以通过排放气体质谱监测废气组合 物以使得材料余量指示甲烷和氧气利用率。可以通过HPLC或单独的质谱分析液体样品以 指示中间物和产物的积聚量。这些值可以与所测量到的放热速率进行比较从而为性能评估 提供置信度。
[0108] 在一些实施例中，图8中示出的设备可以在无癸烷相的情况下使用以提供与可能 的气体混合相关的任何安全限制的初步评估。当获得信任并且证明安全时，可以单独引入 癸烷以形成乳液。在一些实施例中，可以注入癸烷/甲烷泡沫以完全复制最终系统。
[0109] 在其它实施例中，图8中示出的设备可以用于评估MMO活性和甲烷氧化菌生长。在 其它实施例中，如图9中示出的多路复用反应器系统可以用于测量工作条件下的MMO活性 和细胞提取物性能以改良相关性能特征和寿命。
[0110] 另外，在一些实施例中，经济上可能有利的是在无石蜡或其它添加剂支持的情况 下使甲烷氧化菌生长。因此，在一些实施例中，可以将氧气和甲烷递送到有机体以在不使用 石蜡的情况下支持可接受的生长速率和细胞积聚水平。
[0111] 本文所提供的无细胞生物转化工艺可以用于以至少lg/L-h，至少5g/L-h，至少 l〇g/L-h，至少15g/L-h或至少25g/L-h的生产速率生产生物燃料或其它化合物。举例来说， 可以 0· 5g/L-h、lg/L-h、2g/L-h、3g/L-h、4g/L-h、5g/L-h、6g/L-h、7g/L-h、8g/L-h、9g/L_h、 lOg/L-h、llg/L-h、12g/L_h、13g/L_h、14g/L_h、15g/L_h、16g/L_h、17g/L_h、18g/L_h、19g/ 1^1、2(^/1-11、218/1-11、228/1-11、238/1-11、248/1-11、258/1-11或更大的速率生产生物燃料或 其它化合物。在一些实施例中，可以I到5g/L-h，I到10g/L-h，I到25g/L-h，5到10g/L-h， 5到25g/L-h或10到25g/L-h的速率生产生物燃料或其它化合物。
[0112] 大规模生产
[0113] 本发明的一些方面涉及大规模（例如使用大于IOL的反应体积）生产生物燃料 (例如异丁醇）或其它化合物。在本发明之前，若干因素阻止将无细胞生物转化应用到例如 工业和/或商业工艺中。此类因素包括不能控制无细胞系统中的氧化还原平衡以及缺乏将 实现碳通量的快速并且有效的控制的分子生物学工具。本发明使得能够在完全受控制和调 整的环境中使用来自各种微生物的酶，所述环境能够将尤其是甲烷的天然气处理成较高价 值的化学物质，例如异丁醇。
[0114] 在一些实施例中，使用IOL到1，000L反应体积（例如在生物反应器中）进行无细 胞生物转化反应。举例来说，反应体积可以是IOL到100L，IOL到500L，100L到500L，100L 到 1000L 或 500L 到 1000L。
[0115] 在一些实施例中，本文所提供的无细胞生物转化工艺用于每周生产至少IL异丁 醇。在一些实施例中，本文所提供的无细胞生物转化工艺用于每周生产1到100公吨异丁 醇。举例来说，无细胞系统可以用于每周生产10、20、30、40、50、60、70、80、90或100公吨异 丁醇。
[0116] 无细胞系统中的灵活原料
[0117] 无细胞系统实现了细胞生长与目标产量的完全分离。在生物生产过程中在使用混 合碳源（例如来自木质纤维素生物质的呈混合C6和C5糖形式的葡萄糖和木糖）时遇到的 典型挑战包括代谢物阻遏、膜转运以及细胞毒性。无细胞系统避免了这些问题，使得能够更 有效地使用这些便宜的糖源。如蛋白酶靶向的其它技术的使用使得能够有效地针对靶分子 碳骨架以及能量来源和还原等效物同时利用C5和C6糖。
[0118] 包括异戊二烯生产的以下实例：⑴混合型C6(葡萄糖）和Cl (甲烷）原料；以及 (ii)Cl (甲烷）原料。