在非纯性兼养条件中培养微生物和用乙酸盐和/或氧化剂控制培养物中细菌污染的方法

在非纯性兼养条件中培养微生物和用乙酸盐和/或氧化剂控制培养物中细菌污染的方法
【专利说明】在非纯性兼养条件中培养微生物和用乙酸盐和/或氧化剂 控制培养物中细菌污染的方法
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求以下各者的权益：2012年11月9日提交的名称为在兼养条件中培养 微生物的方法（Methods of Culturing microorganisms in Mixotrophic Conditions) 的美国临时申请第61/724, 710号；2013年3月15日提交的名称为兼养系统和方法 (Mixotrophy Systems and Methods)的美国临时申请第 61/798, 969 号；2013 年 3 月 15 日提交的名称为兼养技术（Mixotrophy Technology)的美国临时申请第61/799, 151号； 以及2013年9月13日提交的名称为在非纯性兼养条件中培养微生物的方法（Methods of Culturing microorganisms in Non-Axenic Mixotrophic Conditions)的美国临时申请第 61/877, 894号，所述申请的完整内容特此以引用的方式并入本文中。
【背景技术】
[0003] 例如（但不限于）微藻和蓝藻细菌的微生物由于在例如废水介质的各种条件中快 速生长的能力，已经获得了作为切实可行的食物源、燃料源、肥料源、化妆品源、化学品源和 药物源的关注。每一个微藻种和蓝藻细菌种都具有不同的蛋白质、矿物质和脂肪酸概况，这 使得对于某些产品来说，一些种优于其它种成为更好的来源。不同的微藻种和蓝藻细菌种 可以使用不同的能源和碳源。光养微生物使用光能以及无机碳（例如，二氧化碳）来进行 代谢活动。异养微生物不使用光作为能源，并且实际上关于能量和碳使用有机碳源来进行 代谢活动。兼养微生物可以使用能源和碳源的混合物，包括光、无机碳（例如，二氧化碳） 和有机碳。能够使用各种能源和碳源的兼养微生物的多功能性提供了以下可能性：在对于 专性光养生物或异养生物来说具有挑战性的条件中茁壮成长，并且减少由细胞物质的呼吸 所造成的生物量损失的影响。另外，可归因于光养代谢与异养代谢的比率的兼养微生物的 生长不同于在纯的光养或异养培养物中，产生了限制微生物生长的不同营养物。
[0004] 即使兼养微生物具有使用不同能源和碳源的多功能性，兼养培养物依然面临着其 自身的一套挑战。将使用有机碳源的异养培养物维持在纯性或无菌条件下以防止被细菌、 真菌或使用有机碳源作为进料源的其它不希望的污染性物种污染。这些异养微生物培养物 通常包含封闭、密封并且可高压处理的生物反应器系统，导致成本和复杂性高于简单的敞 开式生物反应器系统。光养微生物培养物可以在非无菌条件中在外部生长以便暴露于自然 光中，其成本低于封闭式异养生物反应器系统，并且不使用有机碳源（有机碳源可以为污 染性细菌提供进料源）。
[0005] 兼养微生物培养物利用光，可以在室外在敞开式生物反应器系统中生长以便获 得自然光，但也包括有机碳源，这使得被培养物中的细菌和其它污染性生物体污染的可能 性增加，这归因于细菌和真菌使用有机碳源生长的速率比兼养型微藻或蓝藻细菌快的能 力。或者，兼养微生物培养物可以在室内在存在环境光或来自人造光源（例如发光二极管 (LED)和荧光灯）的增强光的情况下生长，但是由于有机碳源的存在，所以仍会存在类似的 污染可能性。
[0006] 另外，污染性细菌会影响微生物产物形成（例如，脂质、颜料、蛋白质）和生长。微 生物生长中归因于异养代谢的部分还会受到培养物中所存在的微生物控制。已经证实了， 如果不控制污染性细菌群体并且允许它消耗为微藻和蓝藻细菌所需的资源，那么兼养微生 物培养物中的污染性细菌和其它污染性生物体的增殖对微藻和蓝藻细菌的生产是不利的。 因此，在本领域中需要一种在非纯性兼养条件下有效地培养微藻和蓝藻细菌的方法，所述 方法控制污染并将培养物营养物维持在使微藻和蓝藻细菌的生长达到最大的水平。
[0007] 在一个实施例中，本发明描述一种使微生物在非纯性条件中兼养型生长的方法， 所述方法使用乙酸/恒pH培养（pH auxostat)来供应有机碳源并控制培养物的pH水平。 其它实施例描述采用不同碳源并且也在非纯性条件中操作的替代性方法。本发明公开了现 有技术中未教授的细节，所述细节允许这种方法在非纯性条件、例如敞开式池中运行，同时 维持对细菌污染物的控制。
[0008] 在现有技术中，首先由两个不同的研宄小组在1960年代报告了恒pH培养培 养系统（邦吉（Bungay), 1972;沃森（Watson) 1969)并且由马丁（Martin)和亨普夫林 (Hempfling) (1976)提出了详细进展。虽然这项研宄涉及细菌和酵母培养物，但是拉特雷奇 (Ratledge)和合作者（2001)报告了在异养条件中的基于微藻的乙酸/恒pH培养。由拉 特雷奇使用乙酸作为有机碳源以异养方式培养的寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii) 展示，用乙酸/恒pH培养培养方法，异养型生长和脂质累积改善。虽然拉特雷奇使用了乙 酸/恒PH培养使微藻生长，但是所述系统限于在封闭式发酵系统中的异养物种，其在关于 污染控制方面并不面临与敞开式兼养系统相同的挑战。已经报告了除乙酸以外还采用有机 碳源的在敞开式池中的兼养型单一藻类培养物，但培养物的细菌群体未得到控制或解决。 W02012/109375A2描述了在敞开式池中以低密度以兼养方式生长的小球藻属（Chlorella) 培养物中，利用葡萄糖作为有机碳源，然后收获生物量用于在异养系统中进行脂质生产。由 于兼养期时间短，所以所述培养物不经历与纯粹兼养培养物相同的污染挑战，在更长的时 间内生产出高密度生物量和脂质。
[0009] 此外，乙酸作为杀细菌剂的作用在本领域中是已知的（黄（Huang)等人，2011 ;罗 伊（Roe)等人，2002)，但是到目前为止，其尚未应用于控制大规模兼养型微藻培养物中的 细菌群体。总的来说，已经在实验室规模的实验中在兼养型微藻培养物中利用乙酸，其中标 准实验室条件假定纯性操作并且不解决培养物的细菌群体（叶（Yeh)等人2011)。在US 3,444,647中，村上（Takashi)公开了在含有不同碳源的烧瓶培养物中兼养培养小球藻并 观察到与包含乙酸的培养物相关的较低细菌水平，但是使用CO 2而不是乙酸来控制烧瓶培 养物内的pH水平。最重要的是，US 3, 444, 647没有公开用于控制小规模或大规模微藻培 养物中的污染性细菌的方法或用于使非纯性兼养型生长条件中微藻的生物量产量达到最 大的方法。在此描述的本发明方法基于现有技术进行创新，建立了一种控制异养污染同时 将微藻产量升高到比先前针对照明培养物所描述的水平高的水平（例如，3g/L d)的稳定 方法。

【发明内容】

[0010] 本文中所述的实施例大体上涉及用于在非纯性条件中以兼养方式培养微生物的 系统和方法。具体来说，本文中所述的实施例用有机碳源、氧化剂和气体传递来优化生长并 控制培养物中的污染。
[0011] 在本发明的一些实施例中，在非纯性兼养条件中培养微生物的方法包含：将包含 至少一些污染性细菌的微生物培养物接种到培养器皿中的水性培养基中；向微生物培养物 供应至少一些光；向微生物培养物供应包含有机酸的有机碳源；以及其中微生物培养物维 持污染性细菌的水平低于培养物的总细胞计数的25%并且微生物产量为至少50g/m 2天。
[0012] 在一些实施例中，所述微生物包含至少一种选自由以下组成的群组的属的 微生物：小球藻属、倒囊藻属（Anacystis)、聚球藻属（Synechococcus)、集胞藻属 (Synechocystis)、土壤绿藻属（Neospongiococcum)、绿球藻属（Chlorococcum)、褐指 藻属（Phaeodactylum)、螺旋藻属（Spirulina)、微星藻属（Micractinium)、红球藻属 (Haematococcus)、微拟球藻属（Nannochloropsis)以及咸胞藻属（Brachiomonas)。在 一些实施例中，所述污染性细菌包含选自由以下组成的群组中的至少一种：无色杆菌属 (Achromobacter sp.)、食酸菌属（Acidovorax sp.)、气单胞菌属（Aeromonas sp. )、土壤杆 菌属（Agrobacterium sp·)、交替单胞菌属（Alteromonas sp·)、水螺菌属（Aquaspirillum sp.)、固氮螺菌属（Azospirillum sp.)、固氮菌属（Azotobacter sp.)、伯杰菌属 (Bergeyella sp·)、环丝菌属（Brochothrix sp·)、布鲁米克氏菌属（Brumimicrobium sp.)、伯克氏菌属（Burkholderia sp.)、柄杆菌属（Caulobacter sp.)、纤维单胞菌属 (Cellulomonas sp.)、金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.)、短小杆菌属（Curtobacterium sp.)、代尔夫特菌属（Delftia sp.)、稳杆菌属（Empedobacter sp.)、肠杆菌属 (Enterobacter sp.)、埃希氏菌属（Escherichia sp.)、黄杆菌属（Flavobacterium sp.)、 海杆菌属（Marinobacter sp·)、微杆菌属（Microbacterium sp·)、香味菌属（Myroides sp·)、副球菌属（Paracoccus sp·)、地杆菌属（Pedobacter sp·)、褐杆菌属（Phaeobacter sp.)、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas sp.)、假单胞菌属（Pseudomonas sp.)、拉恩氏 菌属（Rahnella sp.)、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia sp.)、根瘤菌属（Rhizobium sp.)、红球 菌属（Rhodococcus sp·)、玫瑰单胞菌属（Roseomonas sp·)、葡萄球菌属（Staphylococcus sp·)、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp·)、弧菌属（Vibrio sp.)以及周氏菌属 (Zobelliae sp. )〇
[0013] 在一些实施例中，有机碳源的有机酸包含0. 5-50 %乙酸。在一些实施例中，微生物 培养物维持污染性细菌的水平低于培养物的总细胞计数的20%、10%或5%。在一些实施 例中，有机酸与至少一种其它营养物组合并且以组合形式供应到培养基，所述至少一种其 它营养物包含选自由以下组成的群组中的至少一种：硝酸盐、磷酸盐、铁、钴、铜、钠、钼、锰、 锌、盐（salts)以及二氧化硅。在一些实施例中，所述方法进一步包含向微生物培养物供应 至少一种氧化剂，所述至少一种氧化剂包含选自由以下组成的群组中的至少一种：臭氧、过 氧化氢、氯气、亚氯酸盐、氯酸盐、次氯酸盐、硝酸、铬、高锰酸、氧化银以及溴。
[0014] 在一些实施例中，当培养物的经测量pH水平达到阈值水平时，通过恒pH培养系统 (pH auxostat system)向培养物供应有机碳源。在一些实施例中，pH阈值水平是7. 5。在 一些实施例中，恒PH培养系统维持微生物培养物的pH水平基本上恒定。在一些实施例中， 恒pH培养维持pH水平在抑制微生物培养物中的污染性细菌增殖的规定滞后范围内。在一 些实施例中，向培养物供应有机碳源直到培养物的经测量溶解氧水平达到低于2mg 02/L的 临界水平为止。
[0015] 在一些实施例中，水性培养基包含初始浓度介于0. lg/L与6g/L之间的乙酸钠、氢 氧化钠或氢氧化钾。在一些实施例中，每天向微生物培养物供应至少一些光持续10-16、小 于15或大于15小时的光周期。在一些实施例中，所述至少一些光是自然光、人造光或其组 合。在一些实施例中，所述至少一些光包含至少一种来自由以下组成的群组的特定波长光 谱：紫光（约 380-450nm)、蓝光（约 450-495nm)、绿光（约 495-570nm)、黄光（570-590nm)、 橙光（约590-620nm)、红光（约620-750nm)以及远红光（约700-800nm)。在一些实施例 中，培养器皿是安置在室外的敞开式器皿。
[0016] 在本发明的一些实施例中，在非纯性条件中控制兼养型微生物培养物中的细菌污 染的方法包含：将包含至少一些污染性细菌的微生物培养物接种到培养器皿中的水性培养 基中；向微生物培养物供应至少一些光；向微生物培养物供应有机碳源；向微生物培养物 供应氧化剂；以及其中微生物培养物维持污染性细菌的水平低于微生物培养物的总细胞计 数的25%。在一些实施例中，氧化剂包含选自由以下组成的群组中的至少一种：臭氧、过氧 化氢、氯气、亚氯酸盐、氯酸盐、次氯酸盐、硝酸、铬、高锰酸、氧化银以及溴。
[0017] 在一些实施例中，以介于0. lmg/L与2. Omg/L之间的浓度供应臭氧。在一些实施 例中，通过喷雾器和文丘里注射器（venturi injector)中的至少一个向微生物培养物供 应氧化剂。在一些实施例中，所述微生物包含至少一种选自由以下组成的群组的属的微生 物：阿格门氏藻属（Agmenellum)、双眉藻属（Amphora)、项圈藻属（Anabaena)、倒囊藻属、顶 丝藻属（Apistonema)、节旋藻属（Arthrospira(螺旋藻属））、葡萄藻属（Botryococcus)、 咸胞藻属、衣藻属（Chlamydomonas)、小球藻属、绿球藻属（Chloroccum)、十字扁盘石藻属 (Cruciplacolithus)、筒柱藻属（Cylindrotheca)、绿群藻属（Coenochloris)、蓝载藻属 (Cyanophora)、小环藻属（Cyclotel la)、杜氏藻属（Dunaliel la)、艾石属（Emiliania)JS 虫藻属（Euglena)、无管眼藻属（Extubocellulus)、脆杆藻属（Fragilaria)、嘉乐德藻属 (Galdieria)、功奥曲藻属（Goniotrichium)、红球藻属、哈洛绿藻属（Halochlorella)、等 鞭金藻属（Isochyrsis)、细柱藻属（Leptocylindrus)、微星藻属、直链藻属（Melosira)、 蒜头藻属（Monodus)、念珠藻属（Nostoc)、微绿球藻属（Nannochloris)、微拟球藻属、舟形 藻属（Navicula)、土壤绿藻属、菱形藻属（Nitzschia.)、齿状藻属（Odontella)、棕鞭藻 属（Ochromonas)、奥克洛斯藻属（Ochrosphaera)、帕夫洛娃藻属（Pavlova)、皮克路藻属 (Picochlorum)、褐指藻属、颗石藻属（Pleurochyrsis)、紫球藻属（Porphyridium)、波特里 奥洛藻属（Poteriochromonas)、定鞭金藻属（Prymnesium)、红胞藻属（Rhodomonas)、栅藻 属（Scenedesmus)、骨条藻属（Skeletonema)、泡虫属（Spumella)、福节藻属（Stauroneis)、 裂丝藻属（Stichococcus)、奥辛洛藻属（Auxenochlorella)、角毛藻属（Cheatoceros)、 新绿藻属（Neochloris)、棕鞭藻属（Ocromonas)、紫球藻属（Porphiridium)、聚球藻 属、集胞藻属、扁藻（Tetraselmis)、破囊壶菌（Thraustochytrids)以及海链藻属 (Thalassiosira)〇
[0018] 在一些实施例中，有机碳源包含选自由以下组成的群组中的至少一种：乙酸盐、乙 酸、亚油酸铵、阿拉伯糖、精氨酸、天冬氨酸、丁酸、纤维素、柠檬酸、乙醇、果糖、脂肪酸、半乳 糖、葡萄糖、甘油、甘氨酸、乳酸、乳糖、顺丁稀二酸、麦芽糖、甘露糖、甲醇、糖蜜、蛋白胨、基 于植物的水解产物、脯氨酸、丙酸、核糖、蔗糖、淀粉的部分或完全水解产物、蔗糖、酒石酸、 TCA循环有机酸、酒槽水、脲、工业废液以及酵母提取物。
[0019] 在本发明的一些实施例中，在非纯性兼养条件中培养微生物的方法包含：将包含 至少一些污染性细菌的微生物培养物接种到培养器皿中的水性培养基中；向微生物培养物 供应至少一些光；向微生物培养物供应有机碳源；向培养物供应包含氧气的气体；以及其 中所述气体以至少2. 40X KT3iT1的k#供应到所述培养物，并且促使所述微生物的生产率 为至少0.4g/L d。在一些实施例中，kp介于2. 70 X KT3S4与21s η之间。在一些实施例 中，所述微生物的生产率介于〇. 5g/L d与50g/L d之间。
[0020] 在一些实施例中，所述气体通过选自由以下组成的群组中的至少一种供应到微生 物培养物：气体注射器、多孔扩散器、微孔扩散器、透气膜、微泡发生器、文丘里注射以及微 泡流体振荡器。在一些实施例中，有机碳源包含乙酸并且水性培养基包含初始浓度并且在 前1-5天供应的乙酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾。
[0021] 在本发明的一些实施例中，使微生物以兼养方式生长的方法包含：在培养器皿中 提供含微生物培养物的水性培养基，所述微生物能够利用光和有机碳作为能源；向微生物 培养物供应至少一些光；以及向微生物培养物供应包含乙酸和草酰乙酸促进剂的有机碳 源。在一些实施例中，有机酸包含来自由乙酸、乙酸酯和乙酸酐组成的群组中的至少一种。 在一些实施例中，草酰乙酸促进剂包含来自由丙酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和蛋氨酸组 成的群组中的至少一种。在一些实施例中，有机酸比草酰乙酸促进剂的比率介于10:0.01 到10:2的范围内。
【附图说明】
[0022] 图1是对比图，示出了光合自养培养物与兼养培养物之间的细胞干重和以细胞干 重的百分比形式表示的脂质的生产力。
[0023] 图2是对比图，示出了光合自养培养物与兼养培养物之间的细胞干重和以细胞干 重的百分比形式表示的脂质的生产力。
[0024] 图3是对比图，示出了光合自养培养物与兼养培养物之间的NaNO3吸收量，和兼养 培养物的乙酸盐吸收量。
[0025] 图4是对比图，示出了光合自养培养物与兼养培养物之间的NaNO3吸收量，和兼养 培养物的乙酸盐吸收量。
[0026] 图5是对比图，不出了两种兼养培养物的残留乙酸盐。
[0027] 图6是对比图，示出了光合自养培养物和兼养培养物在24小时和14小时光周期 的情况下的细胞干重的生产力。
[0028] 图7是对比图，示出了光合自养培养物和兼养培养物在24小时和14小时光周期 的情况下的硝酸盐吸收量。
[0029] 图8是对比图，示出了兼养培养物在24小时和14小时光周期的情况下的乙酸盐 吸收量。
[0030] 图9是对比图，示出了光合自养培养物和兼养培养物在24小时和14小时光周期 的情况下的溶解氧水平。
[0031] 图10是对比图，示出了光合自养培养物和兼养培养物在24小时和0小时光周期 的情况下的无灰细胞干重生产力，和溶解氧浓度。
[0032] 图11是对比图，不出了兼养培养物和异养培养物的乙酸添加量。
[0033] 图12是对比图，示出了光合自养培养物和兼养培养物在24小时和0小时光周期 的情况下的NaNO3K收量。
[0034] 图13是对比图，示出了两种兼养培养物的细胞干重生产力。
[0035] 图14是对比图，示出了两种兼养培养物的溶解氧水平和最高温度。
[0036] 图15是对比图，示出了兼养培养物的细胞干重生产力、残留NaNOjP溶解氧水平。
[0037] 图16是对比图，示出了兼养培养物的细胞干重生产力、残留NaNOjP溶解氧水平。
[0038] 图17是对比图，示出了两种兼养培养物的细菌计数和温度。
[0039] 图18是对比图，示出了从兼养条件