源供应容器中在包含恒pH培养系统的兼养型生物反应器系统中用 100g/L乙酸和10g/L丙酸（乙酸：丙酸的比率是10:1)培养小球藻属物种。关于培养器 皿，采用运行体积为800ml的鼓泡塔反应器。以半连续模式培养小球藻，其中在兼养型生长 期间每两天收集80%的培养物。培养物收集情况示出在图41中，其中细胞干重曲线图的趋 势线急剧下降。向培养物中添加新鲜培养基（BG-Il)以便在每一次收集时更换损耗的培养 基。
[0219] 将培养物维持在25°C和50体积空气/体积培养物/分钟（VVM)的恒定充气下。 在24小时连续光周期中以200 μ mol光子/m2s给培养器皿的一侧提供荧光灯。培养器皿 上的光程是4cm。在整个实验中，维持细菌水平低于总细胞计数的5%。
[0220] 在接种之后四天并且在第一次半连续收集之后，就细胞密度和生物量生产力来 说，接受乙酸：丙酸（10:1)的有机碳加促进剂处理的培养物开始胜过仅接受乙酸处理的培 养物。到实验结束时，接受乙酸：丙酸（10:1)的有机碳加促进剂处理的培养物显示生产力 超过仅接受乙酸的培养物，增加25%。如图41和表6中所示，乙酸和丙酸的混合物每天表 现得与乙酸一样好或比乙酸好。
[0221] 表 6
[0223] 本领域的技术人员顶多使用常规实验即可认识到或能够确定尤其在本文中所述 的特定实施例的许多等效物。所述等效物打算涵盖在以上权利要求书的范围中。
【主权项】
1. 一种在非纯性兼养条件中培养微生物的方法，其包含： a. 将包含至少一些污染性细菌的微生物培养物接种到培养器皿中的水性培养基中； b. 向所述微生物培养物供应至少一些光； c. 向所述微生物培养物供应包含有机酸的有机碳源；以及 d. 其中所述微生物培养物维持污染性细菌的水平低于所述培养物的总细胞计数的 25 %并且微生物产量为至少50g/m2天。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物包含至少一种选自由以下组 成的群组的属的微生物：小球藻属（Chlorella)、倒囊藻属（Anacystis)、聚球藻属 (Synechococcus)、集胞藻属（Synechocystis)、土壤绿藻属（Neospongiococcum)、绿球 藻属（Chlorococcum)、褐指藻属（Phaeodactylum)、螺旋藻属（Spirulina)、微星藻属 (Micractinium)、红球藻属（Haematococcus)、微拟球藻属（Nannochloropsis)以及咸胞藻 属（Brachiomonas)〇3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述污染性细菌包含选自由以下组成的群组 中的至少一种：无色杆菌属（Achromobacter sp.)、食酸菌属（Acidovorax sp.)、气单胞 菌属（Aeromonas sp.)、土壤杆菌属（Agrobacterium sp.)、交替单胞菌属（Alteromonas sp.)、水螺菌属（Aquaspirillum sp.)、固氮螺菌属（Azospirillum sp.)、固氮菌属 (Azotobacter sp.)、伯杰菌属（Bergeyella sp.)、环丝菌属（Brochothrix sp.)、布鲁米克 氏菌属（Brumimicrobium sp.)、伯克氏菌属（Burkholderia sp.)、柄杆菌属（Caulobacter sp.)、纤维单胞菌属（Cellulomonas sp.)、金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.)、短小 杆菌属（Curtobacterium sp.)、代尔夫特菌属（Delftia sp.)、稳杆菌属（Empedobacter sp.)、肠杆菌属（Enterobacter sp.)、埃希氏菌属（Escherichia sp.)、黄杆菌属 (Flavobacterium sp.)、海杆菌属（Marinobacter sp.)、微杆菌属（Microbacterium sp.)、 香味菌属（Myroides sp.)、副球菌属（Paracoccus sp.)、地杆菌属（Pedobacter sp.)、 褐杆菌属（Phaeobacter sp.)、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas sp.)、假单胞菌属 (Pseudomonas sp.)、拉恩氏菌属（Rahnella sp.)、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia sp.)、根瘤 菌属（Rhizobium sp.)、红球菌属（Rhodococcus sp.)、玫瑰单胞菌属（Roseomonas sp.)、葡 萄球菌属（Staphylococcus sp.)、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.)、弧菌属（Vibrio sp.)以及周氏菌属（Zobelliae sp.)。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述有机碳源的所述有机酸包含0. 5-50%乙酸。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物培养物维持污染性细菌的水平低于所 述培养物的总细胞计数的20%。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物培养物维持污染性细菌的水平低于所 述培养物的总细胞计数的10%。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物培养物维持污染性细菌的水平低于所 述培养物的总细胞计数的5%。8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述有机酸与至少一种其它营养物组合并以组合 形式供应到所述培养基，所述至少一种其它营养物包含选自由以下组成的群组中的至少一 种：硝酸盐、磷酸盐、铁、钴、铜、钠、钼、锰、锌、盐以及二氧化硅。9. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包含向所述微生物培养物供应至少一种氧化 剂，所述至少一种氧化剂包含选自由以下组成的群组中的至少一种：臭氧、过氧化氢、氯气、 亚氯酸盐、氯酸盐、次氯酸盐、硝酸、铬、高锰酸、氧化银以及溴。10. 根据权利要求1所述的方法，其中当所述培养物的经测量pH水平达到阈值水平时， 通过恒pH培养（pH auxostat)系统向所述培养物供应所述有机碳源。11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述pH阈值水平是7. 5。12. 根据权利要求10所述的方法，其中所述恒pH培养系统维持所述微生物培养物的 pH水平基本上恒定。13. 根据权利要求10所述的方法，其中所述恒pH培养系统维持所述微生物培养物的 pH水平在抑制污染性细菌增殖的规定滞后范围内。14. 根据权利要求1所述的方法，其中向所述培养物供应所述有机碳源直到所述培养 物的经测量溶解氧水平达到低于2mg 02/L的临界水平为止。15. 根据权利要求1所述的方法，其中所述水性培养基包含初始浓度的乙酸钠、氢氧化 钠或氢氧化钾。16. 根据权利要求15所述的方法，其中乙酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾的所述初始浓度 介于0. lg/L与6g/L之间。17. 根据权利要求1所述的方法，其中每天向所述微生物培养物供应所述至少一些光 持续10-16小时的光周期。18. 根据权利要求1所述的方法，其中每天向所述微生物培养物供应所述至少一些光 持续小于15小时的光周期。19. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一些光每天供应超过15小时。20. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一些光是自然光。21. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一些光是人造光。22. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一些光是自然光与人造光的组合。23. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一些光包含至少一种来自由以下 组成的群组的特定波长光谱：紫光（约380-450nm)、蓝光（约450-495nm)、绿光（约 495-570nm)、黄光（570-590nm)、橙光（约 590-620nm)、红光（约 620-750nm)以及远红光 (约 700-800nm)。24. 根据权利要求1所述的方法，其中所述培养器皿是安置在室外的敞开式器皿。25. -种控制在非纯性条件中在兼养型微生物培养物中的细菌污染的方法，其包含： a. 将包含至少一些污染性细菌的微生物培养物接种到培养器皿中的水性培养基中； b. 向所述微生物培养物供应至少一些光； c. 向所述微生物培养物供应有机碳源； d. 向所述微生物培养物供应氧化剂；以及 e. 其中所述微生物培养物维持污染性细菌的水平低于所述微生物培养物的总细胞计 数的25%。26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述氧化剂包含选自由以下组成的群组中的至 少一种：臭氧、过氧化氢、氯气、亚氯酸盐、氯酸盐、次氯酸盐、硝酸、铬、高锰酸、氧化银以及 溴。27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述臭氧以介于0. 01mg/L与2. Omg/L之间的浓 度供应。28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述臭氧以介于0.0 lmg/L与0. 50mg/L之间的 浓度供应。29. 根据权利要求25所述的方法，其中通过喷雾器和文丘里注射器（venturi injector)中的至少一个向所述微生物培养物供应所述氧化剂。30. 根据权利要求25所述的方法，其中所述微生物包含至少一种选自由以下组 成的群组的属的微生物：阿格门氏藻属（AgmenelIum)、双眉藻属（Amphora)、项圈藻 属（Anabaena)、倒囊藻属、顶丝藻属（Apistonema)、节旋藻属（Arthrospira (螺旋藻 属））、葡萄藻属（Botryococcus)、咸胞藻属、衣藻属（Chlamydomonas)、小球藻属、绿球藻 属（Chloroccum)、十字扁盘石藻属（Cruciplacolithus)、筒柱藻属（Cylindrotheca)、 绿群藻属（Coenochloris)、蓝载藻属（Cyanophora)、小环藻属（Cyclotella)、杜氏藻属 (Dunaliella)、艾石属（Emiliania)、眼虫藻属（Euglena)、无管眼藻属（Extubocellulus)、 脆杆藻属（Fragilaria)、嘉乐德藻属（Galdieria)、功奥曲藻属（Goniotrichium)、 红球藻属、哈洛绿藻属（Halochlorella)、等鞭金藻属（Isochyrsis)、细柱藻属 (Leptocylindrus)、微星藻属、直链藻属（Melosira)、蒜头藻属（Monodus)、念珠藻属 (Nostoc)、微绿球藻属（Nannochloris)、微拟球藻属、舟形藻属（Navicula)、土壤绿藻属、 菱形藻属（Nitzschia.)、齿状藻属（Odontella)、棕鞭藻属（Ochromonas)、奥克洛斯藻属 (Ochrosphaera)、帕夫洛娃藻属（Pavlova)、皮克路藻属（Picochlorum)、褐指藻属、颗石藻 属（Pleurochyrsis)、紫球藻属（Porphyridium)、波特里奥洛藻属（Poteriochromonas)、 定鞭金藻属（Prymnesium)、红胞藻属（Rhodomonas)、栅藻属（Scenedesmus)、骨条藻属 (Skeletonema)、泡虫属（Spumella)、福节藻属（Stauroneis)、裂丝藻属（Stichococcus)、 奥辛洛藻属（Auxenochlorella)、角毛藻属（Cheatoceros)、新绿藻属（Neochloris)、棕鞭 藻属（Ocromonas)、紫球藻属（Porphiridium)、聚球藻属、集胞藻属、扁藻（Tetraselmis)、 破囊壶菌（Thraustochytrids)以及海链藻属（Thalassiosira) 〇31. 根据权利要求25所述的方法，其中所述污染性细菌包含选自由以下组成的群组中 的至少一种：无色杆菌属、食酸菌属、气单胞菌属、土壤杆菌属、交替单胞菌属、水螺菌属、固 氮螺菌属、固氮菌属、伯杰菌属、环丝菌属、布鲁米克氏菌属、伯克氏菌属、柄杆菌属、纤维单 胞菌属、金黄杆菌属、短小杆菌属、代尔夫特菌属、稳杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、黄杆菌 属、海杆菌属、微杆菌属、香味菌属、副球菌属、地杆菌属、褐杆菌属、假交替单胞菌属、假单 胞菌属、拉恩氏菌属、罗尔斯通氏菌属、根瘤菌属、红球菌属、玫瑰单胞菌属、葡萄球菌属、寡 养单胞菌属、弧菌属以及周氏菌属。32. 根据权利要求25所述的方法，其中所述微生物培养物维持污染性细菌的水平低于 所述培养物的总细胞计数的20%。33. 根据权利要求25所述的方法，其中所述微生物培养物维持污染性细菌的水平低于 所述培养物的总细胞计数的10%。34. 根据权利要求25所述的方法，其中所述微生物培养物维持污染性细菌的水平低于 所述培养物的总细胞计数的5%。35. 根据权利要求25所述的方法，其中所述有机碳源包含选自由以下组成的群组中的 至少一种：乙酸盐、乙酸、亚油酸铵、阿拉伯糖、精氨酸、天冬氨酸、丁酸、纤维素、柠檬酸、乙 醇、果糖、脂肪酸、半乳糖、葡萄糖、甘油、甘氨酸、乳酸、乳糖、顺丁烯二酸、麦芽糖、甘露糖、 甲醇、糖蜜、蛋白胨、基于植物的水解产物、脯氨酸、丙酸、核糖、蔗糖、淀粉的部分或完全水 解产物、蔗糖、酒石酸、TCA循环有机酸、酒槽水、脲、工业废液以及酵母提取物。36. 根据权利要求25所述的方法，其中所述有机碳源与至少一种其它营养物组合并且 以组合形式供应到所述培养基，所述至少一种其它营养物包含选自由以下组成的群组中的 至少一种：硝酸盐、磷酸盐、铁、钴、铜、钠、钼、锰、锌、盐以及二氧化硅。37. 根据权利要求25所述的方法，其中每天向所述微生物培养物供应所述至少一些光 持续10-16小时的光周期。38. 根据权利要求25所述的方法，其中每天向所述微生物培养物供应所述至少一些光 持续小于15小时的光周期。39. 根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一些光每天供应超过15小时。40. 根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一些光是自然光或人造光。41. 根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一些光是自然光与人造光的组合。42. 根据权利要求25所述的方法，其中所述光包含来自由以下组成的群组中的至少一 种特定波长光谱：紫光（约380-450nm)、蓝光（约450-495nm)、绿光（约495-570nm)、黄光 (570-590nm)、橙光（约 590-620nm)、红光（约 620-750nm)以及远红光（约 700-800nm)。43. 根据权利要求25所述的方法，其中所述培养器皿是安置在室外的敞开式器皿。44. 一种在非纯性兼养条件中培养微生物的方法，其包含： a. 将包含至少一些污染性细菌的微生物培养物接种到培养器皿中的水性培养基中； b. 向所述微生物培养物供应至少一些光； c. 向所述微生物培养物供应有机碳源； d. 向所述培养物供应包含氧气的气体；以及 e. 其中所述气体以至少2. 40 X KT3JT1的k p供应到所述培养物，并且促使所述微生物 的生产率为至少0. 4g/L d。45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述k p介于2. 70 X KT3jT1与21s 4之间。46. 根据权利要求44所述的方法，其中所述微生物的所述生产率介于0. 5g/L d与50g/ L d之间。47. 根据权利要求44所述的方法，其中所述微生物的所述生产率介于0. 5g/L d与5g/ L d之间。48. 根据权利要求44所述的方法，其中所述微生物的所述生产率介于0. 5g/L d与 2. 5g/L d 之间。49. 根据权利要求44所述的方法，其中所述污染性细菌包含选自由以下组成的群组中 的至少一种：无色杆菌属、食酸菌属、气单胞菌属、土壤杆菌属、交替单胞菌属、水螺菌属、固 氮螺菌属、固氮菌属、伯杰菌属、环丝菌属、布鲁米克氏菌属、伯克氏菌属、柄杆菌属、纤维单 胞菌属、金黄杆菌属、短小杆菌属、代尔夫特菌属、稳杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、黄杆菌 属、海杆菌属、微杆菌属、香味菌属、副球菌属、地杆菌属、褐杆菌属、假交替单胞菌属、假单 胞菌属、拉恩氏菌属、罗尔斯通氏菌属、根瘤菌属、红球菌属、玫瑰单胞菌属、葡萄球菌属、寡 养单胞菌属、弧菌属以及周氏菌属。50. 根据权利要求44所述的方法，其中所述微生物包含至少一种选自由以下组成的群 组的属的微生物：阿格门氏藻属、双眉藻属、项圈藻属、倒囊藻属、顶丝藻属、节旋藻属（螺 旋藻属）、葡萄藻属、咸胞藻属、衣藻属、小球藻属、绿球藻属、十字扁盘石藻属、筒柱藻属、绿 群藻属、蓝载藻属、小环藻属、杜氏藻属、艾石属、眼虫藻属、无管眼藻属、脆杆藻属、嘉乐德 藻属、功奥曲藻属、红球藻属、哈洛绿藻属、等鞭金藻属、细柱藻属、微星藻属、直链藻属、蒜 头藻属、念珠藻属、微绿球藻属、微拟球藻属、舟形藻属、土壤绿藻属、菱形藻属、齿状藻属、 棕鞭藻属、奥克洛斯藻属、帕夫洛娃藻属、皮克路藻属、褐指藻属、颗石藻属、紫球藻属、波特 里奥洛藻属、定鞭金藻属、红胞藻属、栅藻属、骨条藻属、泡虫属、辐节藻属、裂丝藻属、奥辛 洛藻属、角毛藻属、新绿藻属、棕鞭藻属、紫球藻属、聚球藻属、集胞藻属、扁藻、破囊壶菌以 及海链藻属。51. 根据权利要求44所述的方法，其中所述气体通过选自由以下组成的群组中的至 少一种供应到所述微生物培养物：气体注射器、多孔扩散器、微孔扩散器、透气膜、微泡发生 器、文丘里注射以及微泡流体振荡器。52. 根据权利要求44所述的方法，其中所述有机碳源包含选自由以下组成的群组中的 至少一种：乙酸盐、乙酸、亚油酸铵、阿拉伯糖、精氨酸、天冬氨酸、丁酸、纤维素、柠檬酸、乙 醇、果糖、脂肪酸、半乳糖、葡萄糖、甘油、甘氨酸、乳酸、乳糖、顺丁烯二酸、麦芽糖、甘露糖、 甲醇、糖蜜、蛋白胨、基于植物的水解产物、脯氨酸、丙酸、核糖、蔗糖、淀粉的部分或完全水 解产物、蔗糖、酒石酸、TCA循环有机酸、酒槽水、脲、工业废液以及酵母提取物。53. 根据权利要求44所述的方法，其中所述有机碳源与至少一种其它营养物组合并且 以组合形式供应到所述培养基，所述至少一种其它营养物包含选自由以下组成的群组中的 至少一种：硝酸盐、磷酸盐、铁、钴、铜、钠、钼、锰、锌、盐以及二氧化硅。54. 根据权利要求44所述的方法，其中所述有机碳源包含乙酸并且所述水性培养基包 含初始浓度的乙酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾。55. 根据权利要求54所述的方法，其中乙酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾的所述初始浓度 介于0. lg/L与6g/L之间。56. 根据权利要求54所述的方法，其中在微生物生长的前一到五天供应所述浓度的乙 酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾。57. 根据权利要求44所述的方法，其中所述器皿是安置在室外的敞开式器皿。58. -种使微生物以兼养方式生长的方法，其包含： a. 在培养器皿中提供含微生物培养物的水性培养基，所述微生物能够利用光和有机碳 作为能源； b. 向所述微生物培养物供应至少一些光；以及 c. 向所述微生物培养物供应包含有机酸和草酰乙酸促进剂的有机碳源。59. 根据权利要求58所述的方法，其中所述有机酸包含来自由乙酸、乙酸酯和乙酸酐 组成的群组中的至少一种。60. 根据权利要求58所述的方法，其中所述草酰乙酸促进剂包含来自由丙酸、缬氨酸、 异亮氨酸、苏氨酸和蛋氨酸组成的群组中的至少一种。61. 根据权利要求58所述的方法，其中有机酸比草酰乙酸促进剂的比率介于10:0. 01 到10:2的范围内。62. 根据权利要求58所述的方法，其中所述有机碳源使用恒pH培养器件供应。63.根据权利要求58所述的方法，其中所述微生物包含选自由微藻和蓝藻细菌组成的 群组中的至少一种。
【专利摘要】公开了在非纯性兼养条件中培养微生物的方法。具体描述了一种以兼养方式培养微藻并且用乙酸/恒pH培养(pH auxostat)系统控制细菌污染的方法。还描述了以兼养方式培养微藻，通过增加向所述培养物中的氧传递来增加生产力，并且用氧化剂控制细菌污染的方法。
【IPC分类】C12N1/12, A01G33/00
【公开号】CN104955937
【申请号】CN201380058619
【发明人】艾尼可·格鲁扎, 詹森·D·利卡米勒, 安娜·李·唐克维奇
【申请人】赫里开发公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2013年11月8日
【公告号】CA2888493A1, EP2917333A2, US20150118735, WO2014074769A2, WO2014074769A3, WO2014074769A8