变化相应地改变培养物的溶解氧条件。在实例11中基于化学计量学计算需氧量。在一些 实施例中，可以按远高于化学计量最小值（在实例11中计算为氧利用率比平衡浓度（C*) 的比率）的ha进行培养，从而确保以代谢方式限制反应并且不限制传质。
[0127] 本领域中已知用于增强培养物kp和溶解氧条件的各种方法可以用于兼养微生物 培养方法。本领域中已知的方法可以分成机械法和化学法。在一些实施例中，增强培养物 k#和氧条件的方法可以是机械法或机械法的组合。机械法可以包括（但不限于）添加富 氧空气、文丘里注射、喷射器、堰以及降低培养物的温度。在一些实施例中，增强培养物k# 和氧条件的方法可以是化学法或化学法的组合。化学法可以包括添加含培养物相容产物 (例如臭氧）的高表面积气泡、纳米大小的烃气泡、植物油、矿物油以及纳米大小的金属氧 载体。以上方法中的任一种可以单独或以组合形式使用以增强培养物和氧条件，包括 机械法和化学法的组合。在这些方法中，机械法可能是对培养物生长的侵袭性最小的，并且 可能模块化用于部署。
[0128] 另外，还可以监测溶解氧浓度来管理污染性细菌群体。以好氧方式生长的污染性 细菌可以在培养物中使用过量氧气；因此如果可用于污染性细菌的氧气有限，那么污染性 细菌的生长就会受到限制。
[0129] 实例 1
[0130] 在非纯性条件中使用乙酸/恒pH培养进料系统，使小球藻属SNL 333 (由亚利桑 那州立大学（Arizona State University)分离并且最初在测试时报告为小球藻属的地 方品系；由色色拉梅尔科尼安博士（Dr. Barbara Melkonian)在科隆大学（University of Cologne),佐勒皮休大街（Zillpicher Strasse)47 b, 50674 科隆（ΚδΙη)，德国（Germany) 执行进一步分析，证实微藻品系与其它已知小球藻属共享鉴定特征）在非纯性兼养条件下 生长8天。在8天时间内，按单批形式执行实验，不进行收集。在2英尺X 2英尺平板式气 携光生物反应器中执行试验，其中运行体积是14升（L)。由于添加了乙酸溶液，所以增加 体积直到15L。还在CO 2/丨旦pH培养系统上对光合自养生物（光养）培养物运行对照处理。 以O.lg/L给反应器接种3L小球藻属SNL 333的正以指数方式生长的单一藻类培养物。从 约在0. 5g/L下在BG-Il培养基中运行的室外跑道池获得接种物。然后使培养物适应2英 尺X2英尺平板式光生物反应器直到它们获得1到2. 5g/L的密度为止。向培养物中分批 馈入硝酸盐-磷酸盐溶液，用以维持硝酸盐水平在400与1500ppm之间。将培养物大致维 持在约7. 5的恒定pH和约25°C的温度下。在所述处理中，在24h光周期（恒定光）中使培 养物暴露于来自反应器的每一侧上的FT5-H0 8个灯泡组的光（一个灯泡=259. 6 ymol/ m2s)，并且充气（0. 7升空气/升培养基/分钟）。首先，用25%光强度和C02pH控制开始培 养直到培养物达到0. 5g/L为止，并且然后用50%光强度直到培养物达到2g/L为止。在培 养物达到2g/L之后，借由添加乙酸，开始控制pH处理。CO 2处理包含以1比10的比率向空 气流中注射CO2并且通过螺线管和设定在7. 5的pH控制器控制。
[0131] 乙酸处理系统包含螺线管、蠕动泵和设定在7. 5的pH控制器，用于控制从乙酸进 料槽泵吸到反应器中的乙酸进料。用水将乙酸进料稀释到介于10%与50%浓度之间。将 探针系到进料管，用以确保泵吸稳定并且在PH波动的控制范围内。每24s取样，关于干重 和无灰干重，一式三份，一天一次取样。每天获取污染图片。每2-3天获取单一无损干重样 品（离心200ml)用于冷冻干燥脂肪酸分析。将离心上清液进行冷冻用于通过气相色谱进 行乙酸分析。通过监测乙酸进料槽中的水平测量乙酸消耗量。
[0132] 参看图1-2和表1，结果显不，就细胞干重（g/L)来说，兼养培养物比标准光合自养 (自养生物）培养物多产。表1列举了小球藻属SNL 333的兼养培养物和光合自养培养物 的体积生产力和面积生产力。结果还显示，兼养培养物的脂质含量（干重的％)高于光合 自养培养物。关于表1中所列的值，2X2英尺反应器的表面（照明）比体积比是19L/m 2。 通过使体积生产力乘以Im2中可以含有的体积（19L)计算来自平板式反应器实验的面积生 产力。在兼养中，外推得到的面积生产力克/平方米/天（g/m 2d)假定是300L/m2。另外， 证明兼养而不是光养才是驱动小球藻的兼养型生长。这些结果得出了以下结论：表面（照 明）比体积比对于生长来说不太关键，并且可以放在一平方米中的升的量的限制取决于系 统的氧传递。
[0133] 表 1
[0135] 参看图3-4,结果显不，NaNO3在兼养培养物中的吸收量高于光合自养（自养生物） 培养物。参看图5,结果显示，在使用乙酸/恒pH培养系统，pH水平设定在7. 5的兼养培养 物中的残留乙酸浓度相对较低（比食醋小8倍），并且将携带低风险的环境问题（溢出、挥 发性有机碳排放）、工作危险或底层废弃物。残留乙酸随着硝酸盐和其它营养物的消耗而增 加。
[0136] 实例 2
[0137] 在非纯性条件中使用乙酸/恒pH培养进料系统，使小球藻属SNL 333在非纯性 兼养条件下生长10天。除了曝光期（光周期）、乙酸进料系统和仅在生长期间添加硝酸盐 (不是磷酸盐或微量营养物）之外，用与实例1中所用相同的反应器和程序执行试验。在 10天时间内，还根据实例1中的程序，按单批形式运行试验，不进行收集。以每天在人造光 中24小时的曝光期并且还以在人造光中14小时（每天10小时暗处理）的曝光期运行试 验。通过由针阀控制的滴液系统响应于PH水平控制器馈入乙酸。还在数据记录器中连续 地测量溶解氧水平并且更新。每四天在20X和100X下（油浸没）进行显微镜照相，以及 测量细胞计数、细胞大小、叶绿素含量和不含叶绿素的粒子的比例。
[0138] 参看图6和表2,结果显示，就细胞干重（g/L)来说，兼养培养物胜过光合自养（自 养生物）培养物，并且兼养培养物的细胞干重比光合自养培养物较不受曝光减少的影响。 表2列举了在24h和14h光周期下生长的小球藻属SNL 333的兼养培养物和光合自养培养 物的体积生产力和面积生产力。关于表2中的值，2X2英尺反应器的表面（照明）比体积 比是19L/m 2。通过使体积生产力乘以Im2中可以含有的体积（19L)计算来自平板实验的面 积生产力。在兼养中，外推得到的面积生产力（g/m 2d)假定是300L/m2。另外，基于所述结 果，兼养而不是光养才是驱动小球藻的兼养型生长。
[0139]表 2
[0141] 参看图7,结果显示，NaNO3吸收量对于光合自养（自养生物）培养物来说比对于 兼养培养物来说，更受曝光期减少的影响。参看图8,结果显示，在兼养培养物中，14h曝光 的乙酸吸收量低于24小时曝光。参看图9,结果还显示，溶解氧水平在可能临界点（20%) 饱和，说明在限制兼养培养物的生长方面，在2英尺X 2英尺平板式光生物反应器中氧气的 不良气体传递比光能重要。
[0142] 参看表3,结果显示，尽管是非纯性条件并且引入了有机碳源，但是在兼养培养物 中仍维持低细菌水平。表3列举了在兼养方案或光合自养方案下操作的小球藻属SNL 333 培养物中的细菌群体的发病率。关于表3中所列的值，通过叶绿素自荧光鉴定藻类细胞并 且通过背光绿色模具鉴定细菌细胞。表3的值还假定，小球藻重量是27 X KT12克/细胞并 且细菌细胞重量是〇. 2 X KT12克/细胞。
[0143] 表 3
[0145] 实例 3
[0146] 在非纯性条件中使用乙酸/恒pH培养进料系统，使小球藻属SNL 333在非纯性兼 养条件下生长4天。除了曝光期（光周期）和乙酸进料之外，用与先前在实例2中所述的 相同设备和程序执行试验。试验一和二以24h曝光运行并且试验三和四以Oh曝光（异养） 运行。对于〇. 5到5-6g/L的培养物密度，馈入200g/L乙酸和lg/L初始乙酸钠；并且在超过 5_6g/L的培养物密度下，馈入10g/L乙酸。响应于pH改变，向恒培养器中馈入乙酸。反应 器装有溢流管以便允许超过2X2(14L)生物反应器的操作体积的培养物体积排出（收集） 到4L烧瓶中用于测量和分析。
[0147] 参看图10,结果显示，馈入了乙酸的小球藻培养物在24h曝光中比Oh曝光生长得 好。还发现，光合活动有助于将溶解氧值从近似异养处理（Oh曝光，最小环境光进入）的 4. 9mg/L提高到兼养处理（24h曝光）的6. 5mg/L。参看图11，结果显示，兼养处理（24h曝 光）的乙酸消耗量高于异养处理（Oh曝光）中。参看图12,结果显示，兼养培养物（24h曝 光）的残留NaNO 3浓度低于近似异养培养物（Oh曝光）或光合自养（自养生物）培养物。
[0148] 实例 4
[0149] 使用乙酸/恒pH培养进料系统，使小球藻属SNL 333在非纯性兼养条件下生长10 天。用两个由PVC制成的跑道池光生物反应器执行试验，其中可培养面积是5. 6m2并且光程 (即培养物深度）是l〇cm。两个光生物反应器均含有兼养培养物，用两个50cm多孔扩散器 以10升/分钟（LPM)进行充气，并且位于室外。第一光生物反应器（反应器1)进行水力混 合（泵）。第二光生物反应器（反应器2)用浆轮混合。以0. 3g/L的密度在反应器1和2 中接种小球藻属SNL 333。使小球藻在C02/pH控制下适应室外条件直到它获得0. 3-0. 4g/ L的密度用于实验试验为止。使用先前在实例2中所述的滴液系统发生乙酸添加。
[0150] 视需要当培养物密度达到I. 5g/L时收集培养物。初始培养基是BG-Il培养基，在 初始培养基中补充有乙酸钠（lg/L)。向培养物施加自然阳光，其中平均光周期在2012年 5月亚利桑那州的吉尔伯特（Gilbert，AZ)是约14. 5h。通过冷却盘管将温度控制在28°C。 如先前所述，将恒pH培养系统的pH控制器设定在7. 5。连续测量温度、pH和溶解氧。每天 通过乙酸进料槽水平监测乙酸消耗量。每天获取干重三次（η = 3)并且每天获取硝酸盐水 平。每两天执行旋转减慢以测量残留乙酸盐（200ml)和生物量。
[0151] 每2天执行污染观察（400X UOOOX油浸没-相位对比显微照相和用细菌 染色进行的细胞计数），包括通过流式细胞术测量细菌污染。关于细菌污染测量，向 每1ml样品中添加1 μ I BacLight?绿色细菌染剂（美国俄勒冈州尤金的英杰公司 (Invitrogen，Eugene，OR，USA))，并且在室温下在暗处培育样品30到60分钟。在培育之 后，在BD FACSAria?(美国加利福尼亚州圣何塞的碧迪生物科学公司（BD Biosciences, San Jose, CA, USA))上分析样品并且基于BacLight?焚光和叶绿素自体焚光选通细菌和藻类群 体。
[0152] 参看图13,结果显示，最大日生产力对于反应器1(即，SP3)来说是97g/ m2d(0. 97g/L d)并且对于反应器2(即，SP4)来说是127g/m2d(1.27g/L d)。平均日生产 力（在9天内）对于反应器1来说是56g/m2d(0. 56g/L d)并且对于反应器2来说是76g/ m2d(0. 76g/L d)。室外反应器中兼养培养物的生产力是先前在室外反应器中获得的光合 自养培养物的生产力的大约六倍。参看图14-16,结果显示，反应器1的生产力低于反应 器2 (R2)，还具有较低的溶解氧水平，这对应于将低溶解氧水平与生长限制相关联的先前发 现。参看图17,结果显示，当温度维持在低于30°C时，在室外非纯性兼养条件中，细菌水平 低于总细胞计数的5%(〈0.05%总生物量）。
[0153] 实例 5
[0154] 使用乙酸/恒pH培养系统，使小球藻属SNL 333在非纯性条件中在室外敞开式跑 道池光生物反应器中以兼养方式生长10天，然后转移到平板式光生物反应器中进行光合 自养（光养）生长。如上文在实例4中所述操作室外反应器。以0. 5g/L的密度给平板式 光生物反应器接种来自室外反应器的小球藻培养物，并且在以下条件下操作：25°C的平均 温度，通过CO 2控制的pH 7. 5，在10LPM下充气，在2LPM下施以CO 2脉冲，从光生物反应器 的每一侧上的FTS-HO 8个灯泡组（一个灯泡=259. 6 μ mol/m2s)曝光（光周期）14h。一 天一次收集的数据包括：在750和680nm下的光密度和pH。在试验开始、试验中间和试验 结束时执行干重测量、硝酸盐测量和叶绿素分析。参看图18,结果显示，来自室外反应器的 以兼养方式生长的接种物在转移到用于光合自养型生长的平板式光生物反应器中之后匹 配典型的光合自养（自养）生长速率，并且营养转换是瞬时的。
[0155] 实例 6
[0156] 使用乙酸/恒pH培养系统和向培养基中初始添加乙酸钠，使小球藻属SNL 333以 兼养方式在非纯性条件中生长。以Hh曝光（光周期），使用如先前在实例2中所述的设 备和程序以兼养方式培养小球藻。第一和第四试验最初接受2g/L乙酸钠，并且第二和第三 试验最初不接受乙酸钠。以200g/L馈入乙酸。如先前实验中所述监测干重、无灰干重、溶 解氧、乙酸、细菌污染和硝酸盐。参看图19-20,结果显示，残留乙酸反映了培养基的缓冲要 求，其通过矿物盐（营养物）的消耗量、通过光合过程消耗的CO 2以及由细胞排泄的有机酸 来测定。因此，所述系统不是纯粹的恒培养器（恒定浓度），而是在批量内改变浓度±0. 5g 乙酸/L。结果还显示，初始乙酸钠确保无论光合过程如何，始终存在乙酸盐并且成功激活 pH控制。
[0157] 实例 7
[0158] 使用乙酸/恒pH培养系统，在敞开式池反应器中在非纯性条件中培养小球藻属 SNL 333。除了最初不向培养基中添加乙酸钠之外，使用如先前在实例4中所述的设备Rl 和程序。结果显示，乙酸/恒PH培养系统的激活失败并且生产力相当于在光合自养系统中 所获得的那些。
[0159] 实例 8
[0160] 向大肠杆菌培养物中施加过氧化氢以测定对细菌的抑制作用。向200ml BG-Il培 养基中添加200ml来自被细菌污染的光生物反应器的细菌接种物。将溶液对半平方，第一 溶液接受6. 84g葡萄糖并且第二溶液接受5g乙酸钠。获取两份溶液的pH和光密度。将两 份溶液各自分成三组，每组三份单独的100mL体积，用于对照、IOmM H2O2和20mM H2O2处理。 每一个体积都具有2. 092g MOPS缓冲液（密苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司（Sigma 〇16111；^3131:.1^〇11丨8，]\10))，并且然后放在培育箱中，设定在27°〇、96印1]1和100以1]1〇1/111 28 LED光下。将所述体积培育过夜，然后使用IOM NaOH使pH达到7. 5并测量光密度。然后 添加 IOmM H2O2和20mM H2O2的处理并且培育24h。然后测量光密度和pH，并且向一个体积 的每种处理中添加蛋氨酸。再次在第三天和第六天测量光密度和pH，然后在第六天进行显 微镜分析。结果显示，添加 H2O2对培养物pH的影响极小。参看图21，结果还显示，添加 H2O2 不利地影响葡萄糖和乙酸盐培养基中细菌培养物的生长，其中20mM H2O2处理的影响大于 IOmM H2O2处理。
[0161] 实例 9
[0162] 从微藻培养物中分离出污染性细菌并鉴定为大肠杆菌。使用与实例8中所用相同 的设备和程序，向大肠杆菌培养物中施加不同浓度的过氧化氢以测定对细菌的抑制作用。 用OmM H2O2 (对照）、lmM H202、2.5mM H2O2和5mM H2O2处理葡萄糖和乙酸钠中的细菌培养物。 参看图22,结果显示，随着H 2O2的浓度增加，对细菌生长的抑制作用增加。结果还显示，细 菌培养物生长最终将从一次处理恢复，说明为了控制细菌群体，继续处理将是必需的。由于 细菌的恢复，周期性给予将帮助控制细菌群体。关于含葡萄糖的培养物：2. 5mM H2O2处理应 该每2天给予，或如果使用5mM H2O2处理，那么每6天。关于含乙酸钠的培养物，2. 5mM H2O2 处理应该每3天给予，说明以乙酸盐为食的细菌对氧化应激的灵敏度高于以葡萄糖为食的 藻类。
[0163] 实例 10
[0164] 使小球藻属SNL 333在兼养系统中在上文在实例4中所述的跑道池系统中生长。 跑道光生物反应器的面积是5. 6m2,其中操作体积是568L，深度15cm。一个单元用泵混合 (反应器1)，并且另一个通过浆轮混合（反应器2)。通过气石向浆轮系统中传递空气。通 过文丘里注射系统向泵吸反应器中传递空气。在泵吸反应器中使用喷射器来增加水速并增 强液体培养基的氧传递。生长速率与可用的氧气量成比例。估计20-200g/m 2d的生产力所 需的氧气将是约34-100g/m2d。以0.48g/L给反应器1和反应器2接种小球藻。在第0天 以0. 3g/L的浓度向起始培养物的培养基中添加乙酸钠。馈入系统中的营养物由20%乙酸 和用硝酸盐水平（350mg/L)改良的BG-Il营养物溶液组成。改良的BG-Il配方中的硝酸盐 水平由400mg/L组成，并且通过硝酸盐消耗速率从先前试验测定。
[0165] 在试验期间，通过试验数天，两个系统中的残留硝酸盐均达到0。在试验即将结束 时调整硝酸盐水平以维持系统中的残留硝酸盐（400mg/L)。在整个试验中，每天进行收集。 收集由每天50%培养体积组成，其中80%收集发生在第7天。整个试验对于反应器1来说 持续12天并且对于反应器2来说持续10天。
[0166] 参看图23,结果显示，在反应器1中达到的生物量的最高浓度是1.47g/L(120h)并 且在反应器2中是I. 34g/L(120h)。生物量浓度用无灰干重（AFDW)形式表示，以g/L为单 位。当浓度达到I. 〇g/L或更大时，收集所述系统。收集物由每天50%总培养体积组成，其 中两个系统的80%收集发生在第8天。
[0167] 参看图24,结果显示，基于总培养长度和总平均日产量，对于以g/m2d为单位的跑 道兼养系统的产量来说，反应器1胜过反应器2。反应器1培养运行总共12天，并且反应 器2培养运行总共10天。反应器1在12天时间内的平均日产量是87g/m 2d(包括当培养 物活力由于细菌污染降低时的最后两天）。反应器1中前10天的平均日产量是l〇lg/m2d。 反应器1在10天时间内的平均日产量是76g/m 2d(包括当培养物活力由于细菌污染降低时 的最后两天）。反应器2中前8天的平均日产量是74g/m2d。
[0168] 参看图25,示出了反应器1和反应器2的体积生长速率结果。反应器1中的平均 体积生产力对于12天试验是lg/L d并且对于所述试验的前10天是0. 66g/L d。在试验期 间在反应器1中所达到的最大体积生产力是0. 92g/L d。在反应器2中的平均体积生产力 对于10天试验是0. 49g/L d并且对于所述试验的前8天是0. 50g/L d。在试验期间在反应 器2中达到的最大体积生产力是0. 81g/L d。
[0169] 图26示出了在试验期间的结果产量和乙酸消耗量。反应器1在前七天内平均消 耗2. 31L/d乙酸。反应器2在所述试验的前六天内平均消耗1.83L/d乙酸。图27示出了 在兼养条件下的硝酸盐消耗量。反应器1最多消耗447mg/L d硝酸盐。反应器2最多消耗 350mg/L d〇
[0170] 参看图28,兼养培养物中细菌比小球藻的百分比使用在先前实例中所讨论的程序 进行定量。用于控制细菌群体的处理发生在由垂直虚线所表示的时候。反应器1接受臭氧 处理，并且反应器2接受抗生素处理。在190小时，用于再填充系统的补给水通过氯化进行 灭菌，然后添加到培