改造、扩增和/或以重组方式表达/产生的）中分离 出来。由这些核酸产生的重组多肽可以单独地分离或克隆并且测试所需活性。可以使用任 何重组表达系统，包括细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。
[0071] 例如亚克隆、标记探针（例如使用克列诺聚合酶（Klenow polymerase)、切口平 移、扩增的随机引物标记）、测序、杂交等的核酸操作技术充分描述于科学和专利文献中，参 见例如萨布鲁克（Sambrook),编，分子克隆实验指南（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版），第 1 到3卷，冷泉港实验室（Cold Spring Harbor Laboratory), (1989); 最新分子生物学实验方法汇编（Current Protocols In Molecular Biology),奥斯贝 (Ausubel)，编约翰?威利父子公司（John Wiley&Sons, Inc.)，纽约（1997);生物化学和分 子生物学的实验室技术：使用核酸探针的杂交（Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology:Hybridization With Nucleic Acid Probes),第 I 部分理论和 核酸制备（Theory and Nucleic Acid Preparation),泰杰森（Tijssen)，编埃尔塞维尔 (Elsevier),纽约（1993)，其以引用的方式并入本文中。
[0072] 或者，这些核酸可以通过熟知化学合成技术体外合成，如例如亚当斯（Adams) (1983)美国化学学会杂志（J. Am. Chem. Soc. ) 105:661;贝洛索夫（Belousov) (1997)核 酸研宄（Nucleic Acids Res. )25:3440-3444;夫伦克尔（Frenkel) (1995)自由基生物 学与医学（Free Radic.Biol.Med.) 19:373-380;布隆默斯（Blo_ers)(1994)生物化学 (Biochemistry) 33:7886-7896;纳朗（Narang) (1979)酶学方法（Meth.Enzymol. )68:90; 布朗（Brown) (1979)酶学方法 68:109;博凯奇（Beaucage) (1981)四面体通讯（Tetra. Lett.) 22:1859 ;美国专利第4, 458, 066号中所描述，其以引用的方式并入本文中。
[0073] 编码本发明的酶的核酸可以包含可操作地连接到编码序列上的调节序列。如本文 所使用，调节序列（例如启动子序列）和编码序列在其以一定方式共价连接以使得编码序 列的表达或转录受到调节序列的影响或控制（例如以使得调节序列"驱动"转录启动和/或 编码序列表达）时称为"可操作地"连接。举例来说，对于待转译成功能酶的编码序列，如 果5'调节序列中的启动子的诱导使编码序列被转录并且如果两个DNA序列之间的连接性 质不会（1)导致引入移码突变，（2)干扰启动子区指导编码序列转录的能力，或（3)干扰对 应RNA转录物转译成酶的能力，那么两个DNA序列被视为可操作地连接。因此，如果启动子 区可以实现所述DNA序列的转录以使得所得转录物可以转译成所需酶，那么启动子区将可 操作地连接到编码序列上。
[0074] 当编码本文所提供的酶中的任一者的核酸在细胞中表达时，可以使用多种转录控 制序列来指导其表达。举例来说，核酸可以含有启动子、强化子和/或终止子。或者，核酸插 入于其中的载体可以含有此类调节序列。如本文所使用，"启动子"指的是核酸序列的控制 区，在此处核酸序列的其余部分的转录的启动和速率受到控制。启动子还可以含有子区，在 此处可以结合调节蛋白和分子，如RNA聚合酶和其它转录因子。启动子可以是组成型（例 如未经调节的）、诱导型、激活型、阻遏型、组织特异型的或其任何组合。启动子驱动表达或 驱动其所调节的核酸序列的转录。启动子可以是与基因或序列天然相连的一种启动子，如 通过分离位于编码片段上游的5'非编码序列和/或给定基因或序列的外显子可获得。此 类启动子可以称为"内源的"或"天然的"。在一些实施例中，编码核酸片段安置在重组或异 源启动子的控制下，所述启动子指的是在其天然环境中通常不与经编码的核酸序列相连的 启动子。此类启动子可以包括其它基因启动子、从任何其它原核、病毒或真核细胞中分离出 的启动子以及非"天然存在的"合成启动子，例如经由所属领域中已知的基因工程改造方法 改变表达而含有不同转录调节区和/或突变的不同元件的那些启动子。除以合成方式产生 启动子的核酸序列外，序列还可以使用包括聚合酶链反应（PCR)的重组克隆和/或核酸扩 增技术产生。
[0075] 适合与原核宿主一起使用的启动子包括（但不限于）β -内酰胺酶和乳糖启动子 系统、碱性磷酸酶、色氨酸（trp)启动子系统以及诸多杂合启动子，如tac启动子。然而，其 它已知细菌启动子也是适合的，例如IacI启动子、T3启动子、T7启动子、阿拉伯糖启动子、 gpt启动子、λ PR启动子、APL启动子、来自编码如3-磷酸甘油酸激酶（PGK)的糖酵解酶 的操纵子的启动子以及酸性磷酸酶启动子。其核苷酸序列已公开，从而使得熟练的工作人 员能够使用连接子或衔接子将其与相关序列可操作地连接。适用于细菌系统的启动子还将 含有可操作地连接到编码序列上的夏因 -达尔加诺（Shine-Dalgarno，S. D.)序列。在一些 实施例中，宿主细胞可以经基因修饰以调节代谢物或诱导物转运蛋白的浓度以使得培养物 中的所有细胞都将等效诱导。
[0076] 适用于例如酵母细胞的真核细胞的启动子也是所属领域中已知的。几乎所有真核 基因都具有富AT区，其位于转录起始位点上游约25到30个碱基处。在许多基因转录起点 上游70到80个碱基处可见的另一个序列是CXCAAT区，其中X可以是任何核苷酸。在大多 数真核基因的3'端处是AATAAA序列，其可以是聚A尾加入到编码序列的3'端的信号。所 有这些序列都适当地插入到真核表达载体中。适合与酵母宿主一起使用的启动序列的实例 包括（但不限于）3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，所述糖酵解酶如烯醇酶、 甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、 3_磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶以及葡糖激酶。
[0077] 如本文所使用，"诱导型启动子"是当在诱导物或诱导剂存在下、诱导物或诱导剂 影响下或诱导物或诱导剂接触下时通过引发或增强转录活性来表征的一种启动子。"诱导 物"或"诱导剂"可以是内源的或为通常是外源性的化合物或蛋白质，其以一定方式投与以 在诱导诱导型启动子的转录活性方面起作用。根据本发明使用的诱导型启动子包括本文所 描述或本领域的普通技术人员已知的任何诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括（但 不限于）化学/生物化学调节启动子和物理调节启动子，如异丙基β-D-I-硫代半乳糖苷 (IPTG)调节的启动子、醇调节的启动子、四环素调节的启动子（例如无水四环素（aTc)反 应启动子和其它四环素反应启动子系统，其包括四环素阻遏蛋白（tetR)、四环素操纵序列 (tetO)以及四环素反式激活融合蛋白（tTA))、类固醇调节的启动子（例如基于大鼠糖皮质 激素受体、人类雌激素受体、蛾蜕皮激素受体的启动子以及来自类固醇/类视黄醇/甲状 腺受体超家族的启动子）、金属调节的启动子（例如来源于酵母、小鼠以及人类金属硫蛋白 (结合并且螯合金属离子的蛋白质）基因的启动子）、发病机制调节的启动子（例如通过水 杨酸、乙烯或苯并噻二唑（BTH)诱导）、温度/热量诱导型启动子（例如热激启动子）以及 光调节的启动子（例如来自植物细胞的光反应启动子）。根据本发明可以使用其它诱导型 启动子。
[0078] 如本文所使用，"密码子"指的是编码氨基酸的一组三个相邻核苷酸。在一些实施 例中，针对适用于本发明中的基因工程改造酶的改良表达，使核酸经密码子优化。密码子优 化也称为偏向密码子使用，其指的是在编码DNA过程中同义密码子的出现频率的差异。
[0079] 如本文所使用，"同工酶"指的是不同之处为氨基酸序列但催化相同化学反应或从 起始材料产生相同反应产物的酶。
[0080] 在一些实施例中，本发明的酶可以游离体形式表达。因此，本发明涵盖使用载体， 所述载体包含表达如本文所描述的酶的核酸。如本文所使用，"载体"可以是可以通过限制 和连接插入所需序列的多种核酸中的任一者，用于在不同基因环境之间转运或在细胞中表 达。载体典型地由DNA构成，但RNA载体也是可供使用的。根据本发明的载体的实例包括 (但不限于）质粒、粘粒、福斯质粒（fosmid)、噬菌粒、病毒基因组以及人工染色体（例如 BAC、YAC)。在一些实施例中，本发明的核酸提供于重组克隆载体中。在一些实施例中，核酸 变体在重组表达载体中表达。
[0081] 本发明的克隆载体能够自主复制或整合到细胞基因组中。克隆载体具有核酸内切 酶限制序列，在此处载体可以可确定方式切割，并且在其中可以连接所需DNA序列以使得 新的重组载体保留其在细胞中复制的能力。在质粒的情况下，当细胞（例如细菌）内质粒 拷贝数增加时，所需序列的复制可以进行多次，或在通过有丝分裂进行细胞繁殖之前每个 细胞仅复制一次。
[0082] 本发明的表达载体是通过限制和连接所需DNA编码序列可以插入于其中以使得 其可操作地连接到调节序列上并且可以表达为RNA转录物的一种表达载体。
[0083] 本发明的载体可以进一步包含适用于鉴别经或未经载体转化或转染的细胞的标 记序列。标记包括例如编码提高或降低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的 基因（例如氨苄青霉素抗性基因、康霉素抗性基因、新霉素抗性基因、四环素抗性基因以及 氯霉素抗性基因）、编码具有可通过所属领域中已知的标准分析检测到的活性的酶的基因 (例如半乳糖苷酶、荧光素酶或碱性磷酸酶）以及明显影响经转化或转染的细胞、宿主、 菌落或菌斑的表型的基因（例如绿色荧光蛋白）。在一些实施例中，本文所使用的载体能够 自主复制并且表达与其可操作地连接的DNA片段中所存在的结构基因产物。
[0084] 编码与本发明相关的酶的核酸可以从多种来源处获得。如本领域的普通技术人 员将了解，这些酶的同源基因存在于许多物质中并且可以通过同源性检索，例如经由使用 美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI) 所提供的基于互联网的基础局部比对检索工具（Basic Local Alignment Search Tool， BLAST)来加以鉴别。编码这些酶的核酸可以通过聚合酶链反应（PCR)从含有给定酶的任何 来源的DNA扩增（例如使用简并引物），如本领域的普通技术人员将理解。在一些实施例 中，编码给定酶的核酸可以是合成的。获得编码本文所论述的酶的核酸的任何手段都与本 发明的各方面相容。
[0085] 本发明的酶的表达可以使用所属领域的一般技术人员已知的常规方法测定。这些 方法包括（但不限于）直接RNA扩增、RNA到cDNA的反转录、实时RT-PCR、cDNA扩增、杂交； 以及基于免疫学的分析方法，其包括（但不限于）西方墨点法（Western blotting)、免疫组 织化学、抗体夹层捕获分析、ELISA以及酶联免疫斑点分析（EliSpot分析）。举例来说，测 定如组织或细胞裂解物的样品中的本发明的核酸分子存在水平可以经由任何标准核酸测 定分析进行，所述分析包括PCR或使用标记杂交探针进行分析。此类杂交方法包括（但不 限于）微阵列技术。
[0086] 因此，在一个方面中，本发明涉及以下：涉及酶、编码那些酶的核酸、前述的功能性 修饰和变体的方法以及与其相关的用途。本文所描述的核酸的同源物和等位基因可以通过 常规技术鉴别（参见例如分子克隆实验指南，J.萨布鲁克，等人，编，第二版，冷泉港实 验室出版社，冷泉港，纽约，1989,或最新分子生物学实验方法汇编，F.M.奥斯贝，等人， 编，约翰?威利父子公司，纽约。
[0087] 本发明的各方面涉及一或多种酶在基因工程改造细胞中的表达继而细胞裂