所添加的底物和反应控制试剂（例如PH影响剂、底物）的立即分散。这在一些实施例中使 得能够使用如本文所描述的传统多相催化工艺所采用的技术来实现复杂的生物转化（例 如甲烷转化成生物燃料）。
[0055] 如本文所论述，本发明的一些方面涉及对生物燃料（例如异丁醇）生产有害的酶 的灭活。举例来说，在一些实施例中，可以由蛋白酶以本文所描述的方式靶向丙酮酸脱氢 酶。丙酮酸脱氢酶（EI)是丙酮酸脱氢酶复合物（roc)的第一组分酶。丙酮酸脱氢酶复合 物通过称为丙酮酸脱羧作用的过程有助于将丙酮酸转化成乙酰辅酶A(acet yl-C〇A)。乙酰 辅酶A可以随后用于柠檬酸循环以进行细胞呼吸，因此丙酮酸脱氢酶有助于将糖酵解代谢 路径连接到柠檬酸循环并且经由NADH释放能量。
[0056] 在一些实施例中，可以由蛋白酶以本文所描述的方式靶向甲醛脱氢酶。甲醛脱氢 酶是催化甲醛化学转化成甲酸的酶。
[0057] 甲烷氧化菌
[0058] 本发明的一些方面涉及催化甲烷转化成甲醛并且来源于甲烷氧化菌的酶。酶被认 为"来源于"有机体，只要其在所述有机体中表达或获自所述有机体。因此，在一些实施例 中，本发明的无细胞工艺使用来自甲烷氧化菌（例如巴斯荚膜甲基球菌）的细胞提取物以 提供甲烷单氧酶，其是甲烷活化的生物催化剂。如本文所使用，"甲烷氧化菌"指的是能够代 谢甲烷作为其唯一碳和能量来源的原核细胞。甲烷氧化菌可以在有氧或无氧的情况下生长 并且存活需要单一碳化合物。
[0059] 在一些实施例中，当使用甲烷氧化菌以便将甲烷转化成生物燃料或其它化合物 时考虑的因素包括（不限于）：甲烷氧化菌培养物密度是在2-5年（例如2. 5年）内约每 升5-15克细胞干燥重量（例如每升10克细胞干燥重量）或每升25-100克干燥重量（例 如50克干燥重量每升克干燥重量每升；通过甲烷单氧酶的甲烷氧化的转换频率是约25到 7550^(^ 1 (例如SOsecT1);以及有效催化剂寿命是10到30小时；生物燃料生产和副工艺蛋 白酶靶向的甲烷氧化成前体化合物过程中的还原等效物的净零消耗以确保从甲烷到生物 燃料或其它化合物的最大碳通量。
[0060] 在一些实施例中，使用分批培养系统和/或连续培养系统来系统地操作生长条 件，例如改变氮、磷、铁、铜以及温度，以及添加石蜡（韩（Han) B，等人2009应用微生物学生 物技术学刊（Appl Microbiol Biotechnol)83:669-77)以刺激甲烷氧化菌（例如巴斯荚膜 甲基球菌（Ecapsulatus Bath)中的较高生长速率和细胞密度。因此，在一些实施例中， 氮、磷、铁、铜以及石蜡中的任何一或多者可以用于本发明的无细胞工艺中以提高甲烷氧化 菌生长速率并且增加 MMO积聚。
[0061] 在一些实施例中，甲烷氧化菌的基因组经修饰以具有增强的pMMO表达和活性。
[0062] 重组细菌
[0063] 本发明的一些方面涉及催化甲醛转化成生物燃料或其它化合物并且来源于重组 细菌的酶。如本文所使用，"重组细菌"或"重组细胞"指的是其中引入外来或外源核酸（即， 不是产自细胞的核酸）的细胞。重组细胞可以包括重组核酸（例如DNA或RNA)，其通过组 合不同来源的核酸人工形成。在一些实施例中，外来核酸被整合到细胞基因组中，尽管在其 它实施例中，外来核酸未被整合到细胞基因组中。术语"重组细胞"和"基因工程改造细胞" 在本文中可以互换使用。
[0064] 虽然本文所提供的许多实施例描述了使用重组大肠杆菌（Escherichia coli) (大肠杆菌（E. coli))，但应理解，本发明不限于此，而是涵盖使用任何生长快速并且可以 易于进行基因操作的细菌细胞。因此，与本发明相关的方法包涵来自任何类型细胞（例如 原核细胞和真核细胞）的裂解物。在一些实施例中，所述细胞是细菌细胞，如埃希氏菌属 (Escherichia spp.)、链霉菌属（Streptomyces spp.)、单胞菌属（Zymonas spp.)、醋杆菌 属（Acetobacter spp·)、梓檬酸杆菌属（Citrobacter spp·)、集胞藻属（Synechocystis spp.)、根瘤菌属（Rhizobium spp.)、梭菌属（Clostridium spp.)、棒状杆菌属 (Corynebacterium spp.)、链球菌属（Streptococcus spp.)、黄单胞菌属（Xanthomonas spp.)、乳杆菌属（Lactobacillus spp.)、乳球菌属（Lactococcus spp.)、芽抱杆菌属 (Bacillus spp·)、产喊杆菌属（Alcaligenes spp·)、假单胞菌属（Pseudomonas spp·)、气 单胞菌属（Aeromonas spp·)、固氮菌属（Azotobacter spp·)、丛毛单胞菌属（Comamonas spp.)、分枝杆菌属（Mycobacterium spp.)、红球菌属（Rhodococcus spp.)、葡糖杆菌属 (Gluconobacter spp·)、青枯菌属（Ralstonia spp·)、嗜酸硫杆菌属（Acidithiobacillus spp.)、小月菌属（Microlunatus spp.)、地杆菌属（Geobacter spp. )、土芽抱杆菌属 (Geobacillus spp.)、节杆菌属（Arthrobacter spp.)、黄杆菌属（Flavobacterium spp.)、 沙雷氏菌属（Serratia spp.)、糖多抱菌属（Saccharopolyspora spp.)、栖热菌属（Thermus spp·)、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas spp·)、色素杆菌属（Chromobacterium spp·)、 中华根瘤菌属（Sinorhizobium spp·)、糖多孢菌属、农杆菌属（Agrobacterium spp.)以及 泛菌属（Pantoea spp.)。细菌细胞可以是如大肠杆菌（大肠杆菌（E. coli))细胞的革兰 氏阴性细胞（Gram-negative cell)或如芽孢杆菌种的革兰氏阳性细胞（Gram-positive cell)。在其它实施例中，细胞是真菌细胞，如酵母细胞，例如酵母菌属（Saccharomyces spp.)、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces spp.)、毕赤酵母属（Pichia spp.)、帕菲酵母属 (Paffia spp·)、克鲁维酵母属（Kluyveromyces spp·)、假丝酵母属（Candida spp·)、踝节 菌属（Talaromyces spp.)、酒香酵母属（Brettanomyces spp.)、管囊酵母属（Pachysolen spp·)、德巴利酵母属（Debaryomyces spp·)、耶氏酵母属（Yarrowia spp.)以及工业多 倍体酵母菌株。真菌的其它非限制性实例包括曲霉菌属（Aspergillus spp.)、青霉菌属 (Pennicilium spp·)、镰孢菌属（Fusarium spp·)、根霉菌属（Rhizopus spp·)、枝顶孢属 (Acremonium spp·)、脉抱菌属（Neurospora spp·)、类壳菌属（Sordaria spp·)、稻瘟菌 属（Magnaporthe spp·)、异水霉属（Allomyces spp·)、黑粉菌属（Ustilago spp·)、葡萄 抱属（Botrytis spp·)、果胶杆菌属（Pectobacterium spp.)以及木霉菌属（Trichoderma spp.)。在一些实施例中，所述细胞是藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。应了 解，与本发明相容的一些细胞可以表达与本发明以及重组拷贝相关的基因中的一或多者的 内源拷贝。还应了解，根据本发明使用的一些细胞不含有编码野生型酶（例如对应于引入 细胞中的经基因工程改造的酶的野生型酶）的基因的野生型染色体拷贝。
[0065] 在一些实施例中，使用大肠杆菌细胞，因为其成本低、经充分研究并且可经受基因 操作。在一些实施例中，使用酵母细胞。
[0066] 在一些实施例中，含有催化甲醛转化成生物燃料或其它化合物的酶的细胞裂解物 是经工程改造以过度表达本文所描述的一或多种酶的重组大肠杆菌细胞的裂解物。在一些 实施例中，细胞裂解物是经工程改造以过度表达一组酶，例如两种、三种、四种、五种、六种、 七种、八种、九种、十种、i 种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、 十九种、二十种或大于二十种酶的大肠杆菌细胞的裂解物。在一些实施例中，细胞裂解物是 不同细胞裂解物的组合，例如获自两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或大 于十种不同细胞（例如获自不同生物体，其各自经工程改造以过度表达将甲醛转化成生物 燃料或化合物的一或多种酶）的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或大 于十种不同细胞裂解物的组合。在一些实施例中，组合来自不同生物体（例如不同细菌菌 株）的裂解物。在一些实施例中，组合不同的经工程改造的大肠杆菌菌株（例如过度表达 不同生产路径蛋白质）以使酶含量最优化，之后产生单一经工程改造、具有所有过度表达 蛋白质的菌株。
[0067] 在一些实施例中，本文所提供的细胞是原核细胞，其可以用编码为如本文所提供 的酶的核酸转化。转化和转染分别是将外源基因材料引入原核细胞和真核细胞中的过程。 转化可以通过电穿孔或通过化学手段实现。待转化细胞典型地处于感受态。因此，在一些 实施例中，本文所提供的细胞是电感受态或化学感受态细胞（参见例如多纳休（Donahue) 等人焦点（Focus) 20, 1998,（2) :54-56 ;多纳休等人焦点 20, 1998,（2) : 77-78' 井上（Inoue) 等人基因（661^)96，1990，（1):23-28，其中的每一者以引用的方式并入本文中）。多种电感 受态和化学感受态细胞是所属领域中已知的并且可以根据本发明使用。
[0068] 在一些实施例中，细胞可以包含可选择标记。可选择标记包括（但不限于）编 码提高或降低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因（例如氨苄青霉素 (ampicillin)抗性基因、康霉素（kanamycin)抗性基因、新霉素（neomycin)抗性基因、四环 素抗性基因以及氯霉素（chloramphenicol)抗性基因）、编码具有可通过所属领域中已知 的标准分析检测到的活性的酶的基因（例如半乳糖苷酶、荧光素酶或碱性磷酸酶）以 及明显影响经转化或转染的细胞、宿主、菌落或菌斑的表型的基因（例如绿色荧光蛋白）。 根据本发明还可以使用所属领域中已知的其它可选择标记。
[0069] 如本文所使用，"核酸"指的是共价连接在一起的至少三个核苷酸（例如腺嘌呤、 胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶）的聚合物。聚合物可以包括天然核苷（即，腺苷、胸苷、 鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷以及脱氧胞苷）、核苷类似物（例如2-氨 基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿 苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮 鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟苷、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟甲基）尿苷、二 氢尿苷、甲基假尿苷、1-甲基腺苷、1-甲基鸟苷、Ν6-甲基腺苷以及2-硫代胞苷）、化学改质 碱、生物学改质碱（例如甲基化碱）、插入碱、改质糖（例如2'-氟化核糖、核糖、2'-脱氧核 苷、2' -0-甲基胞苷、阿拉伯糖以及己糖）或改质磷酸基（例如硫代磷酸酯和5' -N-亚磷酰 胺键）。本发明的核酸一般将含有磷酸二酯键。核酸可以是单链（ss)或双链（ds)DNA或 RNA。在一些实施例中，核酸呈cDNA形式。在一些实施例中，核酸呈基因组DNA形式。本发 明的核酸可以呈载体形式，其包括（但不限于）质粒、粘粒以及人工染色体（例如细菌人工 染色体（BAC)和酵母人工染色体（YAC))。其它基于核酸的载体描述如下。
[0070] 本文所使用的核酸（无论RNA、iRNA、反义核酸、CDNA、基因组DNA、载体、病毒或其 混合物）可以从多种来源（基因工程