r>【主权项】
1. 一种用于将甲烷大规模转化成异丁醇的无细胞方法，其包含： 在生物反应器中在高压下，将甲烷、氧气以及含有甲烷单氧酶、甲醇脱氢酶以及催化甲 醛转化成异丁醇的酶的细胞裂解物组合以形成无细胞反应混合物；以及 在适合的条件下培育所述无细胞反应物以将甲烷转化成异丁醇。2. 根据权利要求1所述的无细胞方法，其中所述甲烷单氧酶获自甲烷氧化菌。3. 根据权利要求1或2所述的无细胞方法，其中所述甲醇脱氢酶是异源NAD连接型甲 醇脱氢酶。4. 根据权利要求1到3中任一权利要求所述的无细胞方法，其中催化甲醛转化成异丁 醇的所述酶来源于重组细菌。5. 根据权利要求4所述的无细胞方法，其中所述重组细菌是重组大肠杆菌。6. 根据权利要求1到5中任一权利要求所述的无细胞方法，其中催化甲醛转化成异丁 醇的所述酶包含己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、果糖 二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表异构 酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、乙酰 乳酸合成酶、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、a -酮异戊酸脱羧酶以及异丁醇脱氢酶 中的一或多者。7. 根据权利要求1到6中任一权利要求所述的无细胞方法，其中所述压力是至少1巴。8. 根据权利要求7所述的无细胞方法，其中所述压力是至少2巴。9. 根据权利要求8所述的无细胞方法，其中所述压力是至少5巴。10. 根据权利要求1到9中任一权利要求所述的无细胞方法，其中所述异丁醇以至少 lg/L-h的生产速率生产。11. 根据权利要求10所述的无细胞方法，其中所述异丁醇以至少l〇g/L-h的生产速率 生产。12. 根据权利要求11所述的无细胞方法，其中所述异丁醇以至少25g/L-h的生产速率 生产。13. 根据权利要求1到12中任一权利要求所述的无细胞方法，其中所述生物反应器包 含气相和水相。14. 根据权利要求13所述的无细胞方法，其中所述生物反应器进一步包含有机溶剂。15. 根据权利要求14所述的无细胞方法，其中所述有机溶剂是烷烃。16. 根据权利要求15所述的无细胞方法，其中所述烷烃选自由戊烷、己烷、庚烷、辛烷、 壬烷以及癸烷组成的群组。17. -种用于将甲烷大规模转化成丙酮酸的无细胞方法，其包含： 在生物反应器中在高压下，将甲烷、氧气以及含有甲烷单氧酶、甲醇脱氢酶以及催化甲 醛转化成丙酮酸的酶的细胞裂解物组合以形成无细胞反应混合物；以及 在适合的条件下培育所述无细胞反应物以将甲烷转化成丙酮酸。18. 根据权利要求17所述的无细胞方法，其中所述甲烷单氧酶获自甲烷氧化菌。19. 根据权利要求17或18所述的无细胞方法，其中所述甲醇脱氢酶是异源NAD连接型 甲醇脱氢酶。20. 根据权利要求17到19中任一权利要求所述的无细胞方法，其中催化甲醛转化成异 丁醇的所述酶来源于重组细菌。21. 根据权利要求20所述的无细胞方法，其中所述重组细菌是重组大肠杆菌。22. 根据权利要求17到21中任一权利要求所述的无细胞方法，其中催化甲醛转化成丙 酮酸的所述酶包含己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、果 糖二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表异 构酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶以及丙酮酸激酶 中的一或多者。23. 根据权利要求17到22中任一权利要求所述的无细胞方法，其中所述压力是至少1 巴。24. 根据权利要求23所述的无细胞方法，其中所述压力是至少2巴。25. 根据权利要求24所述的无细胞方法，其中所述压力是至少5巴。26. 根据权利要求17到25中任一权利要求所述的无细胞方法，其中所述异丁醇以至少 lg/L-h的生产速率生产。27. 根据权利要求26所述的无细胞方法，其中所述异丁醇以至少10g/L-h的生产速率 生产。28. 根据权利要求27所述的无细胞方法，其中所述异丁醇以至少25g/L-h的生产速率 生产。29. 根据权利要求17到28中任一权利要求所述的无细胞方法，其中所述生物反应器包 含气相和水相。30. 根据权利要求29所述的无细胞方法，其中所述生物反应器进一步包含有机溶剂。31. 根据权利要求30所述的无细胞方法，其中所述有机溶剂是烷烃。32. 根据权利要求31所述的无细胞方法，其中所述烷烃选自由戊烷、己烷、庚烷、辛烷、 壬烷以及癸烷组成的群组。33. -种用于将甲烷大规模转化成生物燃料或其它化学化合物的无细胞方法，其包 含： 在生物反应器中在高压下，将甲烷、氧气以及含有甲烷单氧酶、甲醇脱氢酶、催化甲醛 转化成丙酮酸的酶以及催化丙酮酸转化成生物燃料或其它化合物的酶的细胞裂解物组合 以形成无细胞反应混合物；以及 在适合的条件下培育所述无细胞反应物以将甲烷转化成所述生物燃料或其它化合物。34. 根据权利要求33所述的无细胞方法，其中所述甲烷单氧酶获自甲烷氧化菌。35. 根据权利要求33或34所述的方法，其中所述甲醇脱氢酶是异源NAD连接型甲醇脱 氢酶。36. 根据权利要求33到35中任一权利要求所述的无细胞方法，其中催化甲醛转化成丙 酮酸和/或丙酮酸转化成所述生物燃料或其它化合物的所述酶来源于重组细菌。37. 根据权利要求36所述的无细胞方法，其中所述重组细菌是重组大肠杆菌。38. 根据权利要求33到37中任一权利要求所述的无细胞方法，其中催化甲醛转化成丙 酮酸的所述酶包含己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、果 糖二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表异 构酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶以及丙酮酸激酶 中的一或多者。39. 根据权利要求33到38中任一权利要求所述的无细胞方法，其中所述压力是至少1 巴。40. 根据权利要求39所述的无细胞方法，其中所述压力是至少2巴。41. 根据权利要求40所述的无细胞方法，其中所述压力是至少5巴。42. 根据权利要求33到41中任一权利要求所述的无细胞方法，其中所述异丁醇以至少 lg/L-h的生产速率生产。43. 根据权利要求42所述的无细胞方法，其中所述异丁醇以至少10g/L-h的生产速率 生产。44. 根据权利要求43所述的无细胞方法，其中所述异丁醇以至少25g/L-h的生产速率 生产。45. 根据权利要求33到44中任一权利要求所述的无细胞方法，其中所述生物反应器包 含气相和水相。46. 根据权利要求45所述的无细胞方法，其中所述生物反应器进一步包含有机溶剂。47. 根据权利要求46所述的无细胞方法，其中所述有机溶剂是烷烃。48. 根据权利要求47所述的无细胞方法，其中所述烷烃选自由戊烷、己烷、庚烷、辛烷、 壬烷以及癸烷组成的群组。49. 一种用于将甲烷大规模转化成异丁醇的无细胞系统，所述系统包含生物反应器，所 述生物反应器包含： 气相，其包含甲烷和氧气；以及 水相，其包含含有甲烷单氧酶、甲醇脱氢酶以及催化甲醛转化成异丁醇的酶的细胞裂 解物。50. 根据权利要求49所述的无细胞系统，其中所述甲烷单氧酶获自甲烷氧化菌。51. 根据权利要求49或50所述的无细胞系统，其中所述甲醇脱氢酶是异源NAD连接型 甲醇脱氢酶。52. 根据权利要求49到51中任一权利要求所述的无细胞系统，其中催化甲醛转化成异 丁醇的所述酶来源于重组细菌。53. 根据权利要求52所述的无细胞系统，其中所述重组细菌是重组大肠杆菌。54. 根据权利要求49到53中任一权利要求所述的无细胞系统，其中催化甲醛转化成异 丁醇的所述酶包含己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、果 糖二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表异 构酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、乙 酰乳酸合成酶、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、a -酮异戊酸脱羧酶以及异丁醇脱氢 酶中的一或多者。55. 根据权利要求49到54中任一权利要求所述的无细胞系统，其中所述生物反应器进 一步包含有机溶剂。56. 根据权利要求55所述的无细胞系统，其中所述有机溶剂是烷烃。57. 根据权利要求56所述的无细胞系统，其中所述烷烃选自由戊烷、己烷、庚烷、辛烷、 壬烷以及癸烷组成的群组。58. -种用于将甲烷大规模转化成丙酮酸的无细胞系统，所述系统包含生物反应器，所 述生物反应器包含： 气相，其包含甲烷和氧气；以及 水相，其包含含有甲烷单氧酶、甲醇脱氢酶以及催化甲醛转化成丙酮酸的酶的细胞裂 解物。59. 根据权利要求58所述的无细胞系统，其中所述甲烷单氧酶获自甲烷氧化菌。60. 根据权利要求58或59所述的无细胞系统，其中所述甲醇脱氢酶是异源NAD连接型 甲醇脱氢酶。61. 根据权利要求58到60中任一权利要求所述的无细胞系统，其中催化甲醛转化成异 丁醇的所述酶来源于重组细菌。62. 根据权利要求61所述的无细胞系统，其中所述重组细菌是重组大肠杆菌。63. 根据权利要求58到62中任一权利要求所述的无细胞系统，其中催化甲醛转化成丙 酮酸的所述酶包含己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、果 糖二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表异 构酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶以及丙酮酸激酶 中的一或多者。64. 根据权利要求58到63中任一权利要求所述的无细胞系统，其中所述生物反应器进 一步包含有机溶剂。65. 根据权利要求64所述的无细胞系统，其中所述有机溶剂是烷烃。66. 根据权利要求65所述的无细胞系统，其中所述烷烃选自由戊烷、己烷、庚烷、辛烷、 壬烷以及癸烷组成的群组。67. -种用于将甲烷大规模转化成丙酮酸的无细胞系统，所述系统包含生物反应器，所 述生物反应器包含： 气相，其包含甲烷和氧气；以及 水相，其包含含有甲烷单氧酶、甲醇脱氢酶、催化甲醛转化成丙酮酸的酶以及催化丙酮 酸转化成生物燃料或其它化合物的酶的细胞裂解物以形成无细胞反应混合物。68. 根据权利要求67所述的无细胞系统，其中所述甲烷单氧酶获自甲烷氧化菌。69. 根据权利要求67或68所述的无细胞系统，其中所述甲醇脱氢酶是异源NAD连接型 甲醇脱氢酶。70. 根据权利要求67到69中任一权利要求所述的无细胞系统，其中催化甲醛转化成异 丁醇的所述酶来源于重组细菌。71. 根据权利要求70所述的无细胞系统，其中所述重组细菌是重组大肠杆菌。72. 根据权利要求67到71中任一权利要求所述的无细胞系统，其中催化甲醛转化成丙 酮酸的所述酶包含己酮糖-6-磷酸合成酶、6-磷酸-3-己酮糖异构酶、6-磷酸果糖激酶、果 糖二磷酸醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、转酮醇酶、核糖-5-磷酸异构酶、核糖-5-磷酸3-表异 构酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶以及丙酮酸激酶 中的一或多者。73. 根据权利要求67到71中任一权利要求所述的无细胞系统，其中所述生物反应器进 一步包含有机溶剂。74. 根据权利要求73所述的无细胞系统，其中所述有机溶剂是烷烃。75. 根据权利要求74所述的无细胞系统，其中所述烷烃选自由戊烷、己烷、庚烷、辛烷、 壬烷以及癸烷组成的群组。76. -种根据权利要求1到75中任一权利要求所述的细胞裂解物。
【专利摘要】本发明在一些方面中涉及用于将甲烷大规模转化成异丁醇的无细胞方法和系统，其包含在生物反应器中在高压下，将甲烷、氧气以及含有甲烷单氧酶、甲醇脱氢酶以及催化甲醛转化成异丁醇的酶的细胞裂解物组合以形成无细胞反应物混合物，以及在适合的条件下培育所述无细胞反应物以将甲烷转化成异丁醇。
【IPC分类】C12P7/64, C12P7/16, C12P7/40
【公开号】CN104955955
【申请号】CN201380071557
【发明人】威廉·杰瑞米·布雷克, 詹姆斯·R·斯沃茨
【申请人】绿光生物科学公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2013年12月20日
【公告号】CA2896079A1, EP2935598A1, US20140193869, WO2014100722A1, WO2014100722A9