生物反应器的反应混合物包括：（i)气相，其递送甲烷和氧气并且去除 CO2，以及（ii)水相或连续相，其包括酶和膜囊泡。在一些实施例中，无细胞生物反应器还包 括有机（非极性）相以递送天然气（包括甲烷）并且优先吸收所需产物（图1)。在一些实 施例中，例如当包括有机相时，水相包括细胞裂解物（例如包括细胞内容物的酶和膜囊泡） 乳液、气相（例如作为空气气泡递送氧气并且去除CO 2并且作为甲烷气泡递送甲烷），以及 有机相（例如有机溶剂的液滴以递送甲烷并且捕获产物）。在一些实施例中，乳液在反应器 外形成。在其它实施例中，乳液经由将有机相高压注入生物反应器中而形成。如本文所使 用，"高压"指的是至少1巴的压力。举例来说，高压可以指至少1巴、至少2巴、至少5巴或 至少10巴的压力。在一些实施例中，高压可以指1到5巴、1到10巴或5到10巴的压力。
[0036] 有机相的有机溶剂可以是烷烃。如本文所提供的适用的烷烃的实例包括（但不 限于）戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷以及癸烷。可以使用其它有机溶剂。举例来说，具有以 下特性的有机溶剂涵盖在本文中：（i)使用其导致无细胞反应中的丙酮酸生产率降低小于 10%，以及（ii)在大气压下甲烷溶解性大于25mg/L到30mg/L (例如23mg/L) 〇
[0037] 图2显示本发明的非限制性示例性无细胞工艺的图式。工艺的每个步骤用数1到8 值指示。在步骤1中，重组甲烷氧化菌表达将天然气中的甲烷转化成甲醛的酶。在步骤2中， 重组大肠杆菌（Escherichia coli)(大肠杆菌（E.coli))表达将甲醛转化成生物燃料（在 这种情况下为异丁醇）的酶，并且还提供分隔蛋白酶（参见例如国际公开号W02010/077806 和TO 2012/030980,其以引用的方式并入本文中）。所述蛋白酶分解例如目标甲醛脱氢酶 (由甲烷氧化菌表达），其已经工程改造以含有同源蛋白酶识别位点。甲醛脱氢酶将甲醛转 化成甲酸，并且因此，其在无细胞反应系统中干扰甲醛到生物燃料或其它化合物的转化。因 此，当来自步骤1和步骤2的生物体裂解并且在步骤3中组合时，蛋白酶从其细胞区室（例 如周质）释放并且分解甲醛脱氢酶，从而使其失活。甲醛脱氢酶的这一灭活提高了生物燃 料的转化产率。甲烷转化成生物燃料在步骤4中在经工程改造并且受计算机控制的生物反 应器（其在例如10巴下加压以针对例如至少1，至少5,至少10,至少15,至少20或至少25 克/升-小时的体积生产率驱动质量转移速率）中进行。步骤4的生物反应器包括多相流 体，其含有水相以支持细胞裂解物的酶催化剂以及任选地有机相以帮助递送天然气或甲烷 并且吸收产物生物燃料。在一些实施例中，这些相在步骤5中分离以递送有机相以便在步 骤6中去除燃料。在一些实施例中，随后用天然气（或甲烷）再补给有机相并且在多个位 置处注回到生物反应器中。在一些实施例中，空气和天然气可以单独地注入。此外，在一些 情况下，外部热交换器以及冷却水套去除过程热并且控制反应器温度。为了确保安全操作， 典型地在整个反应器中的多个温度传感器检测可能由自燃引起的任何"热点"。这触发甲烷 和/或空气注入的立即减少以及分布入口的再次平衡。
[0038] 应理解，无细胞工艺中的一些步骤可以同时或依次进行。举例来说，将甲烷转化成 甲醛的酶的表达和将甲醛转化成生物燃料的酶的表达可以在细胞裂解前同时进行（例如 在反应器的单独区室中）。
[0039] 图3显示本发明的无细胞工艺的另一个非限制性实例的图式。为清楚起见，未显 示如接种物制备发酵器、压缩器、冷却器、热交换器以及泵的元件。在这一实例中，通过离心 浓缩甲烷氧化菌，之后将其与未经离心的重组大肠杆菌培养物组合。组合细胞保持在冷冻 槽中同时等待用高压均质器裂解。随后离心细胞裂解物并且传送到第二储料槽中。在一些 实施例中，基于16%烷烃（例如癸烷）中的所估计的生物燃料吸附容量，每小时大致将一 半无细胞反应流体从反应器泵吸到倾析离心机中。去除气相并且分离液相。在一些实施例 中，将有机相转移到蒸馏装置中以便移出生物燃料。随后冷却经再次纯化的烷烃并且注入 甲烷以产生冷冻的含甲烷的烷烃泡沫以便分布回到无细胞反应器中。去除约10%留在倾析 离心机中的水相以维持无细胞反应器中的恒定体积并且去除任何可能的水溶性毒素。随后 冷却水性催化剂物流，之后单位置进入生物反应器中。
[0040] 无细胞系统
[0041] 本文所提供的无细胞工艺准许在细菌（例如大肠杆菌）发酵期间表达（例如从细 菌人工染色体）多种酶。在一些实施例中，将底物（例如甲烷）转化成所需化学产物（例 如丙酮酸）的酶在重组（典型地快速生长的）细菌菌株（例如大肠杆菌）中表达。在细 胞采集和裂解之前，酶积聚到最优水平。细胞裂解使得周质表达的蛋白酶（下文论述）能 够省略侧面路径，将碳分流到相关产物中。最优化化学环境激活由细胞裂解期间形成的内 部膜囊泡催化的呼吸，从而提供ATP的丰富供应并且去除过量还原等效物以在需要时回 收NAD+和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+)(参见国际公开号WO 2010/077806和 W02012/030980,其以引用的方式并入本文中）。
[0042] 如本文所使用，"无细胞"组合物指的是实质上不含完整细胞的组合物。本领域的 技术人员将理解，裂解后，一定百分比，例如小于10%，小于5%，小于2%，小于1 %或小于 0. 5%的细胞可以是完整的。如本文所使用，"无细胞系统"是一种分离的无细胞系统，其含 有明确经工程改造以包括酶或酶级联的细胞裂解物或提取物，所述酶或酶级联以给定工序 (例如在酶促路径中）和比例在所确定的底物上作用时产生所需产物（例如生物燃料或其 它化合物或其中间物）。
[0043] 如本文所使用，"细胞裂解物"指的是含有裂解细胞内容物的流体。细胞裂解物可 以是全细胞裂解物和/或粗（未纯化）细胞裂解物。在一些实施例中，细胞裂解物可以经 部分纯化（例如去除细胞碎片/颗粒，如受损外部细胞膜）。在一些实施例中，细胞裂解物 通过高压裂解制备，从而形成实现细胞裂解物中的氧化磷酸化的细胞内膜囊泡。制备细胞 裂解物的其它方法在所属领域中是众所周知的，并且包括（但不限于）超声处理、均质化、 使用溶菌酶的酶裂解以及冷冻和研磨。
[0044] 超声处理包括通过液体剪切力和空蚀来裂解细胞。DNA也是在超声处理期间剪切 的，因此可能不需要将脱氧核糖核酸酶（DNase)添加到细胞悬浮液中。典型地，将细胞悬浮 液保持在冰上以控制温度，并且可以使用具有停顿（10-30秒）的较短脉冲（5-10秒）来再 次确立低温。
[0045] 可以使用均质器来通过向细胞悬浮液加压并且突然释放压力来按压裂解细胞。这 产生能够裂解细胞的液体剪切力。一般需要多个（2-3)回合来实现充分裂解。然而，较高 操作压力导致操作温度升高。因此，使用前可以冷却（4°C)压力细胞。除温度控制外，应注 意避免蛋白质因发泡而失活。
[0046] 酶裂解是基于通过溶菌酶消化细菌细胞壁的肽聚糖层。然而，革兰氏阴性细菌 (Gram-negative bacteria)具有细胞壁外的外膜并且可能需要使其透化以暴露肽聚糖层。 Tris缓冲盐水在裂解方法中通常用作缓冲液，其有效地使外膜透化。这一作用可以通过添 加如乙二胺四乙酸（EDTA，例如ImM)的螯合剂加以增强。EDTA螯合稳定薄膜的镁离子。在 细胞裂解期间，DNA释放并且可能需要添加脱氧核糖核酸酶（lmg/ml)以降低制剂粘度。酶 细胞裂解可以在任何规模上进行。为了提高细胞裂解水平，还可以超声处理溶液。
[0047] 另一种裂解方法是直接在液氮中冷冻细胞并且使用研钵和研杵（其用液氮冷冻） 将冷冻细胞研磨成粉末。粉末可以无限期地储存在-80 °C下，并且可以通过将粉末添加到缓 冲液中来制备细胞裂解物。
[0048] 在具有生产所需生物燃料或其它化学化合物所需的至少一种底物、辅因子或其组 合的无细胞系统中组合甲烷氧化菌和重组细菌的细胞裂解物。如本文所使用，"底物"是能 够提供合成相关化合物需要的所需元素的化合物或化合物混合物。在某些实施例中，底物 可以指碳源。在一些实施例中，甲烷是底物。
[0049] 如本文所使用，"辅因子"是蛋白质的（例如酶的）生物活性所需的非蛋白质化学 化合物。在一些实施例中，辅因子是甲烷到生物燃料或其它化学化合物的无细胞生物转化 所需的。辅因子的实例包括（但不限于）隱0!1、隱0+、4了？、40?、？丨以及隱0?!1。在一些实施 例中，辅因子由细胞提取物提供（例如存在于细胞提取物中）。
[0050] 蛋白酶靶向
[0051] 本发明的一些方面使用以下方法：通过使对生物转化工艺的特定阶段有害的一或 多种酶失活来抑制（例如消除或减少）非所需副反应。在一些实施例中，有害的酶是在生 物合成路径中催化限速步骤的一种酶。在一些实施例中，这通过工程改造酶以包括蛋白酶 识别位点来实现。此类重组酶典型地具有选择性地位于其一级氨基酸序列的蛋白酶识别序 列，从而使得尽管存在识别序列，但重组蛋白的活性足以实现细胞的野生型生长。可以选择 性地通过同源蛋白酶的引入、表达和/或活化来使重组酶失活，所述同源蛋白酶尤其在蛋 白酶识别序列处分解重组靶蛋白，从而使重组酶无活性（或活性降低）。同源蛋白酶被隔离 到细胞区室（例如周质）中直到重组酶的灭活是所需的为止，此时使蛋白酶与重组酶接触 以分解酶并且使其失活。
[0052] 可以通过在特定识别序列处分解的多种蛋白酶中的任一者来使本文所提供的重 组酶失活。如本文所使用，在酶的情况下，"蛋白酶识别序列"指的是同源蛋白酶识别并且分 解的氨基酸序列。在编码蛋白质的核酸的情况下，"蛋白酶识别序列"指的是编码同源蛋白 酶所识别并且分解的氨基酸序列的序列。如本文所使用，"同源蛋白酶"指的是分解重组酶 并且从而使其失活的蛋白酶。本文中可以使用的同源蛋白酶包括具有单一特定的识别序列 的那些，意指所述蛋白酶在一或多种氨基酸的特定序列内或邻近处分解。在一些实施例中， 本发明的蛋白质用经工程改造的人类鼻病毒3C蛋白酶识别序列制备。
[0053] 根据本发明可以使用的蛋白酶的其它实例包括（但不限于）丙氨酸羧基肽酶、 蜜环菌奸红素 （Armillaria mellea astacin)、细菌亮氨酰基氨基肽酶、癌促凝物质、组 织蛋白酶B、梭菌蛋白酶、细胞溶质丙氨酰基氨基肽酶、弹性蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、 肠激酶、胃亚蛋白酶、明胶酶、Gly-X羧基肽酶、甘氨酰基内肽酶、人类鼻病毒3C蛋白酶、 皮蝇素 C、Iga特异性丝氨酸内肽酶、亮氨酰基氨基肽酶、亮氨酰基内肽酶、lysC、溶酶体 pro-X羧基肽酶、赖氨酰基氨基肽酶、甲硫氨酰基氨基肽酶、粘细菌（myxobacter)、苯乙肼 裂解酶（nardilysin)、胰腺内肽酶E、皮克耐因（picornain)2A、皮克耐因3C、前肽链内切 酶（proendopeptidase)、脯氨酰基氨基肽酶、前蛋白转化酶I、前蛋白转化酶II、罗塞尔酶 (russellysin)、糖胃蛋白酶（saccharopepsin)、激肽释放酶（semenogelase)、T 纤溶酶 原激活物、凝血酶、组织激肽释放素、烟草蚀刻病毒（TEV)、托加韦因（togavirin)、色氨酰 基氨基肽酶、U纤溶酶原激活物、V8、维诺宾（venombin)A、维诺宾AB以及Xaa-pro氨基肽 酶（参见罗林斯（Rawlings), S.D·，等人，蛋白水解酶手册（Handbook of Proteolytic Enzymes),学术出版社（Academic Press) ,2013，科学（Science),埃尔塞维尔有限公司 (Elsevier Ltd.)，第4094页，对于与其中所描述的蛋白酶的结构化学和生物方面相关的 其教示内容，以引用的方式并入本文中）。根据本发明可以使用其它蛋白酶。
[0054] 细菌（例如大肠杆菌）的细胞质或周质中的酶的区室化提供了过度表达生物合成 路径的组分并且在不影响细胞健康和生长的情况下积聚特定蛋白酶的机会。当例如通过可 调式高压均质器使细胞裂解时，细胞内区室混合以激活路径并且使有害酶失活；本质上重 塑催化系统。这在一些情况下准许低成本生产酶催化剂。另外，在一些实施例中，在整个反 应体积中不存在细胞壁和大分子催化剂的分散液准许进行精确抽样以便于在线监测以及