21个AGAAA基序和11个GTGA基序，TaASG036_2启动子中有17个AGAAA基序和11个GTGA基序，TaASG036_3启动子中有I个AGAAA基序和8个GTGA基序。AGAAA基序和GTGA基序是与花粉/花药特异表达相关的顺式调控元件，TaASG036_l、TaASG036-2和TaASG036_3基因的启动子中多个AGAAA基序和GTGA基序的存在表明该启动子可能是与花粉/花药特异表达有关的启动子。
[0014]为了进一步验证这两个启动子的功能，将其中一个启动子SEQ ID N0:5与报告基因GUS相连，转化植物，在转基因水稻的根、茎和叶等营养器官中都检测不到GUS基因的表达，在花粉处于减数分裂期的穗子和花粉处于单核期、双核期和三核期的除花药以外的其它花器官中也检测不到⑶S基因的表达，TaASG036-l启动子只能启动⑶S基因在花粉处于单核期、双核期和三核期的花药中表达，说明本发明所提供的启动子是一个花粉发育晚期花药特异表达的启动子。
[0015]本发明所提供的植物花药特异表达启动子，含有序列表中SEQ ID N0:5、6或7所示的核苷酸序列，或包含与SEQ ID N0:5、6或7所列核苷酸序列具有90%以上相似性的核苷酸序列，或包含来源于SEQ ID N0:5、6或7序列上的100个及100以上连续的核苷酸片段，并且可以驱动与该启动子操作性连接的核苷酸序列在植物花药中的表达。含有上述序列的表达载体、转基因细胞系以及宿主菌等均属于本发明的保护范围。扩增本发明所公开的SEQ ID N0:5、6或7启动子的任一核苷酸片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0016]本发明所提供的启动子核苷酸序列还可用于从小麦以外的其它植物中分离相应序列，尤其是从其他单子叶植物中进行同源克隆。根据这些相应序列与本文所列启动子序列间的序列同源性，或与本启动子基因的同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本发明所列的SEQ ID N0:5、6或7启动子序列(或其片段)间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。
[0017]本发明所述的“启动子”是指一种DNA调控区域，其通常包含能指导RNA聚合酶II在特定编码序列的合适转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子还可包含其它识别序列，这些识别序列通常位于TATA盒的上游或5’端，通常被称为上游启动子元件，起调控转录效率的作用。本领域技术人员应该知晓，虽然已经鉴定了针对本发明公开的启动子区域的核苷酸序列，但是分离和鉴定处于本发明鉴定的特定启动子区域的TATA盒上游区域的其它调控元件也在本发明的范围内。因此，本文公开的启动子区域通常被进一步界定为包含上游调控元件，例如用于调控编码序列的组织表达性和时间表达功能的那些元件、增强子等。以相同的方式，可以鉴定、分离出使得能在目标组织(例如雄性组织)中进行表达的启动子元件，将其与其它核心启动子一起使用，以验证雄性组织优先的表达。核心启动子指起始转录所需的最小限度的序列，例如被称为TATA盒的序列，这是编码蛋白质的基因的启动子通常都具有的。因此，可选地，本发明所述的SEQ ID N0:5、6或7启动子可与其自身的或来自其它来源的核心启动子关联使用。
[0018]核心启动子可以是任何一种已知的核心启动子，例如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子(美国专利N0.5，352，605)、泛素启动子(美国专利N0.5，510，474)、IN2核心启动子(美国专利N0.5，364，780)或玄参花叶病毒启动子。
[0019]所述基因启动子的功能可以通过以下方法进行分析:将启动子序列与报告基因可操作性连接，形成可转化的构建体，再将该构建体转入植株中，在获得转基因后代中，通过观察报告基因在植物各个组织器官中的表达情况来确认其表达特性；或者将上述构建体亚克隆进用于瞬时表达实验的表达载体，通过瞬时表达实验来检测启动子或其调控区的功能
[0020]用来测试启动子或调控区域功能的适当表达载体的选择将取决于宿主和将该表达载体引入宿主的方法，这类方法是本领域普通技术人员所熟知的。对于真核生物，在载体中的区域包括控制转录起始和控制加工的区域。这些区域被可操作地连接到报告基因，所述报告基因包括YFP、UidA、GUS基因或荧光素酶。包含位于基因组片段中的推定调控区的表达载体可以被引入完整的组织，例如阶段性花药，或引入愈伤组织，以进行功能验证。
[0021]启动子的活性和强度可以根据其驱动的报告基因的mRNA或蛋白质的表达量来测定。报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来确定目的基因的表达调控特性。常用的报告基因有葡萄糖苷酸酶基因GUS，和绿色荧光蛋白基因GFP。
[0022]本发明通过⑶S报告基因来检测启动子的活性和表达特性。根据⑶S基因检测所用的底物不同，有三种检测方法:组织化学法、分光光度法和荧光法(灵敏度为分光光度检测法最高)，其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞转入了⑶S基因，并表达出了⑶S酶蛋白，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使各组织细胞中有GUS表达活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性的强弱。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。
[0023]此外，本发明的启动子可与并非TaASG036-l、TaASG036_2或TaASG036_3基因的核苷酸序列相连，以表达其它异源核苷酸序列。本发明的启动子核苷酸序列及其片段和变体可与异源核苷酸序列一起组装在一个表达盒中，用于在目的植株中表达，更具体地，在该植株的雄性器官中表达。所述表达盒有合适的限制性酶切位点，用于插入所述启动子和异源核苷酸序列。这些表达盒可用于对任何植株进行遗传操作，以获得想要的相应表型。
[0024]本发明所公开的TaASG036_l启动子、TaASG036_2启动子和TaASG036_3启动子，可用于驱动下列异源核苷酸序列的表达，以使转化的植株获得雄性不育的表型。所述异源核苷酸序列可编码促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，更具体的如a淀粉酶基因、生长素(auxin)，rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素，或者可选自原核调控系统，还可以是显性的雄性不育基因。
[0025]在某些实施方式中，本发明中所提到的可操作地连接在本发明启动子下游的核酸，其中所述的“核酸”可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。
[0026]本发明所提供的启动子序列可分离自任何植物，包括但不限于芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节养属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(Rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(Spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(Gra_a grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘鹿、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，植物包括玉米、大豆、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、稻、棉花和高粱。
[0027]本发明还包括含有TaASG036_l启动子、TaASG036_2启动子或TaASG036_3启动子的构建体，所述构建体包括通常所说的载体或表达盒。上述构建体中还可包括其它组分，这主要取决于载体构建的目的和用途，例如可进一步包括选择标记基因、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。表达盒还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止子。终止子可以是本发明所提供基因的终止子，也可以是来自外源的终止子。更具体地，上述终止子可以是胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶终止区域。
[0028]在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，例如质体、造粉体，或者引向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，表达盒还可包含用于编码转运肽的核苷酸序列。此类转运肽是本领域所公知的，其包括但不限于Rubisco的小亚基、植物EPSP合酶、玉米Brittle-1叶绿体转运肽等。
[0029]在制备表达盒的过程中，可对多种DNA片段加以操作，以提供处于合适方向，或是处于正确读码框中的DNA序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将DNA片段连起来，或者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。
[0030]进一步地，本发明所提供的构建体中还可包括选择标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述选择标记基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁嶙抗性基因。所述选择标记基因还可以是红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙Pl等基因。
[0031]本发明所提供的表达盒或载体可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源