GGGGAGAACT-3，(SEQ ID NO: 10)
[0053]引物4:5’-AACTAGACGACCAGAGTAGACAGAGC-3’ (SEQ ID NO: 11)
[0054]TaASG036-3 基因的 RT-PCR 引物为:
[0055]引物5:5’-GAGTCTGCATCCGCGTGCTA-3’ (SEQ ID NO: 12)
[0056]引物6:5，-GCCTCCCTAGCTAATAACAAAGACC-3，(SEQ ID NO: 13)。
[0057]实施例3.TaASG036-l、TaASG036_2和TaASG036_3基因启动子序列的获得和顺式元件分析
[0058]从TaASG036-l、TaASG036_2 和 TaASG036_3 基因的 cDNA 序列出发，利用 CerealsDB和 IWGSC (Internat1nal Wheat Genome Sequencing Consortium)公布的普通小麦的测序信息，以及2013年Nature上发表的小麦祖先乌拉尔图小麦(Triticum urartu, A基因组供体)和粗山羊草(Aegilops tauschii，D基因组供体)的测序信息进行电子克隆，获得了 TaASG036-l、TaASG036_2 和 TaASG036_3 基因的启动子，长度分别为 2267bp、2065bp 和2049bp，序列分别如 SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:7 所示。
[0059]利用PlantCARE 数据库和 PLACE 数据库，对 TaASG036_l、TaASG036_2 和TaASG036-3基因的启动子进行顺式元件分析。如图3所示，翻译起始位点ATG用粗体下划线表示，以翻译起始位点ATG的A定义为“+1”，AGAAA基序用阴影表示，GTGA基序用方框表示。TaASG036-l基因启动子中有21个AGAAA基序和11个GTGA基序，TaASG036_2基因启动子中有17个AGAAA基序和11个GTGA基序，TaASG036_3基因启动子中有I个AGAAA基序和8个GTGA基序。AGAAA基序和GTGA基序是与花粉/花药特异表达相关的顺式调控元件，TaASG036-l、TaASG036_2和TaASG036_3基因的启动子中多个AGAAA基序和GTGA基序的存在表明该启动子可能是与花粉/花药特异表达有关的启动子。
[0060]实施例4.TaASG036-l启动子的克隆和植物表达载体的构建[0061 ] 将植物表达载体pBI 121用限制性内切酶Hindi 11和EcoRI双酶切，得到的35S:⑶S片段用T4DNA Iigase连入同样用HindIII和EcoRI双酶切的CAMBIA公司的PCAMBIA2300载体，新的载体被命名为p230035S:⑶S。
[0062]从TaASG036_l启动子的5’端和ATG上游设计引物:
[0063]引物7:5，-ctgcag TGATTTATACAAAAAATGTACAGAGCATATG-3’ (SEQ ID NO: 14)；
[0064]引物8:5，-actagt TGGCGCAGCGCGCAGATGCAAAC-3，(SEQ ID NO: 15)；
[0065]引物7中序列ctgcag是PstI的酶切位点，引物8中序列actagt是SpeI的酶切位点。
[0066]以小麦的基因组DNA为模板，用引物7和引物8进行扩增，反应条件是:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒；60°C退火30秒；72°C延伸2分30秒；35个循环；72°C延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-Tl-simple载体中，筛选阳性克隆并进行测序验证，序列如SEQ ID N0:5所示，该质粒称为p231。
[0067]用限制性内切酶PstI和SpeI双酶切p231，得到的TaASG036_l启动子用T4DNAIigase连入用PstI和XbaI双酶切的p230035S:⑶S载体，得到植物表达载体p235，该质粒的结构如图4所示。
[0068]实施例5.农杆菌介导的水稻遗传转化及转基因植株的分子鉴定
[0069]利用热激法将植物表达载体p235转入农杆菌AGLO菌株。
[0070]用农杆菌侵染水稻胚性愈伤，暗中共培养2-3天，然后经过两步抗性筛选、预分化、分化和生根培养等步骤，最终获得具有卡那霉素抗性的、转P235水稻TO代植株。
[0071]设计引物对转基因水稻植株进行PCR鉴定。
[0072]引物9:5’-CGGTATGAATATTGCAAAGCCAG-3’ (SEQ ID NO: 16)
[0073]引物10:5，-GCCGTCGAGTTTTTTGATTTCAC-3，(SEQ ID NO: 17)
[0074]反应条件为:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸I分30秒；30个循环；72°C延伸10分钟。扩增的是TaASG036-l启动子和⑶S的部分片段，长度为1304bp。鉴定结果表明，利用农杆菌介导的水稻转化获得的抗性再生植株是转p235基因的阳性植株。
[0075]实施例6.转基因水稻植株不同组织器官⑶S基因表达的组织化学检测
[0076]X-Gluc 母液:10mg X-Gluc 溶于 5ml DMF0
[0077]X-Gluc 基液:50mM PBS ρΗ7.0，1mM EDTA.2Na，0.1 % Triton X-100，5mM 铁氢化钾，0.5mM亚铁氢化钾。
[0078]X-Gluc 使用液:50 μ I 母液 +950 μ I 基液。
[0079]选择合适大小的带有⑶S报告基因的转基因幼苗或特定组织浸入⑶S染液中，37°C染色过夜，吸去反应液，乙醇梯度脱色，显微镜观察照相。
[0080]对p235转基因水稻植株各组织器官的⑶S染色结果如图5，在转基因水稻的根、茎和叶等营养器官中都检测不到GUS基因的表达(图5A-C)，在花粉处于减数分裂期的花和花粉处于单核期、双核期和三核期的除花药以外的其它花器官中也检测不到GUS基因的表达，TaASG036-l启动子只能启动⑶S基因在花粉处于单核期、双核期和三核期的花药中表达(图OT-G)，说明TaASG036-l启动子是一个花粉发育晚期花药特异表达的启动子。进一步，花粉处于单核期的花药壁中检测不到GUS的表达(图5H)，而单核期、双核期和三核期的花粉中能够检测到⑶S的表达(图51-K)，因此，TaASG036-l启动子是一个小麦花粉发育晚期特异表达的启动子。
【主权项】
1.一种启动子，具有花药特异表达的特性，其特征在于所述启动子的核苷酸序列选自下列组的序列之一: Ca)具有SEQ ID NO:5、6或7所示的序列； (b)在严格条件下能够与(a)所述序列的DNA杂交的DNA序列； (c)包含SEQID NO:5、6或7中至少100个连续核苷酸的DNA序列；和 (d)与(a)- (c)之任一所述序列互补的DNA序列。2.一种表达盒，具有在花药中特异表达的特性，其特征在于所述表达盒包含权利要求1所述的启动子序列。3.—种表达载体，其特征在于所述表达载体包含权利要求2所述的表达盒。4.一种工程菌，其特征在于所述工程菌含有权利要求3所述的表达载体。5.—种在植物中表达目的核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物体导入DNA构建体，所述DNA构建体含有启动子及操作性连接于所述启动子的目的核苷酸序列，其中所述启动子的核苷酸序列选自下列组的序列之一: Ca)具有SEQ ID NO:5、6或7所示的序列； (b)在严格条件下能够与(a)所述序列的DNA杂交的DNA序列； (c)包含SEQID NO:5、6或7中至少100个连续核苷酸的DNA序列；和 (d)与(a)- (c)之任一所述序列互补的DNA序列。6.权利要求5所述的方法，其中所述的植物为单子叶植物，优选为禾本科植物，更优选的为水稻或小麦。7.权利要求5所述的方法，其中所述的目的核苷酸序列可以是结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA，其在花粉发育晚期的特异性表达可以调节花粉的育性及花粉萌发。8.权利要求5所述的方法，其中所述的目的核苷酸序列可以是编码促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，更具体的如玉米a淀粉酶基因、生长素，rotB、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素，或者可选自原核调控系统，还可以是显性的雄性不育基因。9.权利要求1所述的启动子在以下(a)至(d)中任一项中的应用: (a)培育植物品种或品系； (b)培育授粉受精能力增强植物品种或品系； (C)培育授粉受精能力消弱的植物品种或品系； Cd)培育雄性不育植物品种或品系。10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的植物为单子叶植物，所述单子叶植物优选为禾本科植物，更具体的，所述禾本科植物优选为水稻或小麦。
【专利摘要】本发明属于植物生物技术领域，具体涉及植物花药特异表达启动子的分离和功能鉴定及应用。本发明所公开的启动子在植物的花药中特异表达，在植物转基因领域具有很好的应用前景。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/74, C12N15/84, C12N15/113, C12N1/21
【公开号】CN104975022
【申请号】CN201510150544
【发明人】李健, 马力耕, 邓兴旺
【申请人】未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司, 兴旺投资有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年4月1日