一种分离纯化仙鹤草中间苯三酚类化合物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及天然有机化学领域，具体涉及一种分离纯化仙鹤草中间苯三酚类化合物的方法。
【背景技术】
[0002]仙鹤草，为蔷薇科植物龙牙草(Agrimonia polosa Ledeb)的干燥地上部分，具有收敛止血、截疟、止痢、解毒、补虚等功能，用于治疗咯血、吐血，崩漏下血，疟疾，血痢，痈肿疮毒，阴痒带下，脱力劳伤等。现代药理研宄发现仙鹤草有抗肿瘤、降血糖、降血压、抗氧化等多种活性，是一种对人类有显著保健作用的天然药材。
[0003]仙鹤草全草含有多种化学成分，如仙鹤草素、鞣酸、挥发油、留醇、有机酸、酚类、黄酮类和糖苷类等。目前，人们已尝试运用不同的技术手段对其化学成分进行了分离和鉴定，然而酚类结构的化合物(尤其是间苯三酚类化合物)，其分离纯化的方法还是以传统的柱色谱技术为主，例如在《仙鹤草地上部分仙鹤草酚B的分离与鉴定》一文中应用硅胶及Sephadex LH-20柱色谱技术对仙鹤草石油醚提取物进行分离纯化，用石油醚、氯仿洗脱，结果分离鉴定了一个丁酰基间苯三酚类化合物，即仙鹤草酚B (贺成、秦文杰、唐晓晶、陈玉武、叶祖光，《中草药》，2011年第2期255-256页)；又例如在《HPLC法测定仙鹤草中鹤草酚含量及鹤草酚结构的2DNMR分析研宄》一文中通过溶剂提取及硅胶柱色谱反复分离，制备薄层，Sephadex LH-20以及多次重结晶手段，从仙鹤草根芽的95%乙醇提取物分离得到了鹤草酚、仙鹤草酚B、伪绵马素这三个间苯三酚类化合物(杜超，沈阳药科大学0)]，2008年)。上述分离技术的缺陷之处在于:①由于间苯三酚类化合物在仙鹤草中含量低、极性弱，采用传统的柱色谱技术对间苯三酚类样品分离时会产生有较强吸附，导致样品大量损失，收率降低；?分离步骤繁琐，需要多种柱色谱联用，如硅胶、凝胶柱等，洗脱剂采用大量有机溶剂，不但分离效率低，而且不够安全、环保、经济。
[0004]高速逆流色谱(High-SpeedCounter Current Chromatography, HSCCC)是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，利用样品在互不相溶的两相中的分配能力不同，使得各组分得以分离。因其两相均为液体，能够很好地克服传统分离技术的缺点，可避免样品的不可逆吸附、失活、变性等问题，且具有一次性制备量大、产物得率较高、仪器操作简易并运行成本低等优点。HSCCC溶剂体系按极性通常分为强极性、中等极性、弱极性和无水体系，前三者均为含水体系，而无水体系是指纯有机相构成的两相溶剂体系；含水体系是目前常用的用于分离天然产物的HSCCC溶剂体系。
[0005]经检索，目前有两篇专利文献采用了 HSCCC分离仙鹤草中的成分。其中一篇是公开号为CN101775028的中国发明专利，公开了一种富集纯化仙鹤草素的方法，其特点是采用高速逆流色谱含水的强极性体系和中等极性体系从仙鹤草70%丙酮浸提液中，经过两次HSCCC分离得到98%纯度的仙鹤草素。该专利与本发明的差异之处在于:①目标化合物的结构和极性差距大。该专利分到的仙鹤草素是个极性较大的化合物，本发明分到的间苯三酚二缩合体为极性非常弱的化合物；②溶剂体系的区别。该专利采用脂肪脂、脂肪醇及水为溶剂体系，适合分离中等或强极性的化合物，不适于极性很弱的化合物，本发明的化合物由于极性非常弱，在水相中保留率低，所以会导致目标物质在水相中因无保留而无法分离。
[0006]另一篇是公开号为CN102329206的中国发明专利，公开了一种鹤草酚的制备方法，方法是:1)取仙鹤草药材粉碎，加5-10倍量60-90%乙醇溶液回流提取2-3次，提取液加活性炭脱色，过滤浓缩，浓缩液用氯仿萃取，萃取液回收试剂，得粗提物；2)将上述粗提物采用高速逆流色谱含水体系分离，紫外检测器监测，根据图谱收集目标成分，流分减压回收试剂，干燥即得高纯度鹤草酚。该专利与本发明的差异之处在于:①目标化合物的极性差距较大。鹤草酚为单苯环结构，且含不饱和六元环酮，因此极性也较仙鹤草中其他的间苯三酚类化合物大鹤草酚可以采用常规的含水体系进行分离，但仙鹤草中石油醚提取出来的极性较鹤草酚弱的间苯三酚类化合物无法用含水体系分离获得。
[0007]我们知道，仙鹤草中的间苯三酚类化合物多为间苯三酚二缩合体以及间苯三酚三缩合体，而且同系物和同分异构体较多，该类化合物极性很弱(鹤草酚除外)，采用HSCCC常规溶剂体系不能达到分离的目的，是天然产物分离中的一大技术难题。因此，综上所述，采用何种方法，能够同时高效地分离得到低极性的间苯三酚类化合物尤其是本发明所涉及的间苯三酚二缩合体化合物，是本领域技术人员急需解决的技术难题。
【发明内容】
[0008]本发明目的在于提供了一种分离纯化仙鹤草中极性极弱的间苯三酚类化合物的方法，实现快速、高效、环保地分离，以解决现有技术存在的上述缺陷。
[0009]为实现上述发明目的，本发明以仙鹤草提取物作为分离对象，采用薄层色谱筛选溶剂体系，并用高速逆流色谱无水溶剂体系法分离纯化，得到两个间苯三酚化合物，经鉴定为伪绵马素(pseudo-aspidin)、a -Kosin0
[0010]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0011]一种分离纯化仙鹤草中间苯三酚类化合物的方法，取仙鹤草粗提物，先后经过两次高速逆流色谱法纯化处理，得到间苯三酚类化合物，其中:
[0012](I)第一次高速逆流色谱法分离纯化
[0013]采用由溶剂Α、溶剂B、溶剂C组成的溶剂体系，各组分的体积比为A:B:C = (10?12): (0.5?I): (O?0.5)，混合均匀，静置分层，分液得到上下两相溶液；以上相为固定相，下相为流动相，先将固定相填满逆流色谱分离柱，再泵入流动相，取仙鹤草粗提物用两相溶液溶解后进样，按梯度时间间隔分管收集洗脱液，分段合并，回收溶剂，得间苯三酚类化合物的混合物；
[0014](2)第二次高速逆流色谱法分离纯化
[0015]采用由溶剂D、溶剂B、溶剂E组成的溶剂体系，各组分的体积比为D:B:E =10:7:3，混合均匀，静置分层，分液得到上下两相溶液；以上相为固定相，下相为流动相，先将固定相填满逆流色谱分离柱，再泵入流动相，并将流动相的出液口与进液口连通以形成闭合回路；取步骤(I)分离得到的混合物用两相溶液溶解后进样，循环洗脱，直至分离得到间苯三酚类化合物的单体；
[0016]溶剂A为正己烷、环己烷、正庚烷、石油醚、乙腈中的一种或几种；溶剂B为二氯甲烷、三氯甲烷中的一种或几种；溶剂C为甲醇、乙醇中的一种或几种；溶剂D为正己烷；溶剂E为乙腈。
[0017]优选的，步骤(2)中高速逆流色谱采用闭合回路循环的次数为7次。
[0018]优选的，步骤⑴中的仙鹤草粗提物，由如下方法制得:将仙鹤草粉末用石油醚回流提取，过滤，合并滤液，回收溶剂，残渣经溶剂萃取后，浓缩，即得。
[0019]更优选的，仙鹤草粗提物的制备方法中，提取溶剂选用石油醚60?90°C ;萃取溶剂选用氯仿、5 %氢氧化钠中的一种或几种。
[0020]优选的，两次高速逆流色谱法的分离条件为:柱温10?20 °C，转速700?lOOOrpm，优选800?900rpm，流动相的流速为2?5mL/min，检测波长为285nm。
[0021]优选的，溶剂A为体积比为1:1的正己烷与乙腈的混合液或体积比为1:1的石油醚与乙腈的混合液，溶剂B为二氯甲烷，溶剂C为甲醇。
[0022]更优选的，第一次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为6:6:0.5:0.5的正己烷、乙腈、二氯甲烷、甲醇组成，第二次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为10:7:3的正己烷、
二氯甲烷、乙腈组成。
[0023]更优选的，第一次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为5:5:0.5的正己烷、乙腈、二氯甲烷组成，第二次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈组成。
[0024]更优选的，第一次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为6:6:0.5:0.5的石油醚、乙腈、二氯甲烷、甲醇组成，第二次高速逆流色谱的溶剂体系由体积比为10:7:3的正己烷、
二氯甲烷、乙腈组成。
[0025]更优选的，第一次