一种检测活体中硒代半胱氨酸的新方法
【专利说明】一种检测活体中硒代半胱氨酸的新方法 【技术领域】
[0001] 本发明属于有机合成及检测领域，具体地说涉及一种二硝基苯磺酰基修饰的可生 物降解的聚碳酸酯胶束的合成方法及其对组织中的硒代半胱氨酸的检测。以聚碳酸酯作为 疏水链，采用环状碳酸酯的开环聚合（ROP)简便的合成了两亲聚合物。然后叠氮与炔烃在 铜催化下发生Huisgen1，3-偶极环加成的偶联反应形成了对Sec响应的聚碳酸酯胶束。 【【背景技术】】
[0002] 在1969年，Se的抗癌能力在美国被发现，而且发现硒的摄入量也一直与许多疾病 有关。低分子量的硒化合物，如甲硒醇和硒代半胱氨酸（Sec)是关键的代谢物，并且发现其 在癌症预防方面很重要。特别是硒代半胱氨酸，它是一种低分子量的重要的含硒氨基酸， 且位于硒蛋白的活性位点，并由尿鸟腺苷（UGA)终止密码子来编码的。此外，Sec可以进入 硒蛋白的活性部位，而硒蛋白的功能广泛，包括从氧化还原信号作用、抗炎作用到活跃的 甲状腺激素的分泌。Sec在物种体内控制着各种含硒化合物的多种功能以及在癌症治疗中 也起着重要的作用。到目前为止，很少有文献报道检测Sec或硒蛋白的荧光探针。在2006 年，Maeda等报道了一种可区别硒醇中Sec和Cys的焚光探针BESThio,该探针可使Sec更 具有反应性，且Ph值5. 8时其为离子化形式。在2014年张等报道了在pH值7. 4的生理条 件下，根据相同的机理设计、合成了一系列潜在Sec探针并对其进行了生物评估。在2015 年，Kong等发展了一种检测活细胞中Sec的荧光方法来获得Sec的生理功能，同时研究了 Se对肿瘤细胞的抑制机制。但是由于缺乏细胞渗透性和滞留（EPR)效应（要求具有潜在的 破坏性的负载技术或高染色浓度），抗光漂白和生物相容性仍然限制了生物医学的广泛应 用。受这样先例的启发，我们在这里构建了包含有化学反应和生物可降解聚合物胶束的Sec 检测系统。胶束可以在生理条件下成像内源性Sec，这表明在活宫颈癌组织以及HeLa细胞 中PMPC-Dns胶束探针可以成像，同时释放包裹的药物。
[0003] 目前，国内外还没有关于二硝基苯磺酰基修饰的可生物降解的聚碳酸酯胶束的合 成及其对组织中的硒代半胱氨酸检测的公开文献和专利申请。 【
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的在于提供一种二硝基苯磺酰基修饰的可生物降解的聚碳酸酯胶束 来检测组织中的硒代半胱氨酸的方法。该包裹着荧光药物DOX的PMPC-Dns可以在生理 条件下（pH值7. 4)选择性地响应Sec和其他硒醇，而对其他生物硫醇、胺或醇干扰很小。 PMPC-Dns胶束探针也可应用于成像Hela细胞中的内源性Sec，并且在生理条件下的活的宫 颈癌组织中，PMPC-Dns胶束探针能成像并同时释放包裹在其中的药物。为达到上述发明目 的，本发明提出以下的技术方案：
[0005] 将Sec的识别位点2, 4-二硝基苯磺酰基与聚碳酸酯主链的疏水端发生共聚。当 PMPC-Dns共聚物和阿霉素（DOX)置于水溶液中，胶束发生自组装，并且疏水的阿霉素被包 裹在胶束中。当有Sec时，识别位点与Sec发生反应导致2, 4-二硝基苯磺酰基断裂，且疏 水端变为亲水性的羟基端使胶束解离。胶束的解离释放出包裹的阿霉素，从而使胶束荧光 强度增强而达到检测的目的。
[0006] 上述检测方法中，以2, 4-二硝基苯磺酰基与聚碳酸酯主链为底物制定了聚合物 的合成路线。
[0007] 上述检测方法中，以聚合物来制备胶束。
[0008] 上述检测方法中，以荧光检测法测定了临界胶束的浓度（CMC)。
[0009] 上述检测方法中，以MTT比色法检测细胞的毒性。
[0010]上述检测方法中，以荧光法来确定PMPC-Dns胶束对Sec检测的工作原理及可行 性。
[0011] 上述检测方法中，以荧光法来检测Sec的灵敏性和选择性。
[0012] 上述检测方法中，以PMPC-Dns胶束来检测细胞和组织中的Sec。
[0013] 本发明所提供的PMPC-Dns胶束，是具有刺激响应的胶束，其特点是稳定、简单、灵 敏、成本低、轻便、以及易存储。PMPC-Dns胶束是第一个可用于Sec诱导的选择性胶束探针。 【【附图说明】】
[0014] 附图所示是本发明提供的合成二硝基苯磺酰基修饰的可生物降解的聚碳酸酯胶 束化合物的路径图。 【【具体实施方式】】
[0015] 本发明所提供的合成二硝基苯磺酰基修饰的可生物降解的聚碳酸酯胶束化合物 的反应路线，请参见附图。
[0016] 下面结合具体的制备例对本发明做进一步说明：
[0017]PMPC-Dns胶束合成
[0018] 3-叠氮-1-丙醇的合成
[0019] 向50mL反应管中，加入1.02g3-溴丙醇，0.95g叠氮钠，再加入IOmL蒸馏水，于 80°C下反应18h，停止加热，冷却至常温，加乙酸乙酯萃取，取上层液，再用盐水溶液洗涤，无 水硫酸镁干燥，过滤，滤液收集，除去溶剂得无色的3-叠氮-1-丙醇，产率76. 5%。
[0020] 2, 4-二硝基苯磺酸丙酯的合成（Dns-N3)
[0021] 向50mL圆底烧瓶中，加入0. 57g3-叠氮丙醇，I. 56mL三乙胺，再加入IOmL无水二 氯甲烷，于(TC下缓慢加入无水二氯甲烷溶解的2, 4-二硝基苯磺酰氯，搅拌，反应18h，加水 萃取，取上层液，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液收集，除去溶剂得粗产物，过柱分离（PE:EA= 5 :1)，得到产物，产率72%。
[0022] 2, 2-二羟甲基丙酸丙炔酯的合成（2)
[0023] 向50mL圆底烧瓶中，加入2. 24g2,2-二羟甲基丙酸，1.018氢氧化钾，再加入2〇1^ DMF，于KKTC下反应2h，再逐滴加入2. 13g溴丙炔，半小时滴毕，反应72h，停止反应，过滤， 减压旋干溶剂，加CH2Cl2溶解，饱和的盐水溶液萃取（20mLX3)，收集有机相得粗产物，过柱 分离（PE:EA= 5 :1)，得到产物，产率45. 14%。
[0024]MPC的合成
[0025] 向50mL两口圆底烧瓶中，加入I. 18g化合物2，1.48g氯甲酸乙酯，再加入20mL DMF，氮气保护下于冰浴下搅拌lh，再逐滴加入I. 39g三乙胺，半小时滴毕，反应3h后于室温 下过夜反应，过滤，减压旋干溶剂，粗产物用乙酸乙酯：乙醚=1:1重结晶，得到白色结晶产 物，产率91. 05%。
[0026] PEG-b-poly(MPC)的合成
[0027] MPC的开环聚合是采用标准的希莱克技术，在氮气保护下进行的。向50mLSchlenk 瓶中，加入 〇.594gMPC，0.601gPEG5k，0.055gTU，0.005gDBU，再加入IOmLCH2Cl2，橡胶塞 封口，再经过冷冻为固态-抽真空-解冻三次循环，室温搅拌7h，加冰乙醚析出沉淀，离心分 离，过滤，旋干溶剂，得到白色粉末产物，产率92. 0%。
[0028] 点击化学合成PMPC-Dns
[0029] 向 50mLSchlenk瓶中，加入 302. 9mgPEG-b-poly(MPC)，245. 06mgDns_N3,17.Img 抗坏血酸钠，再加入4mLDMF，橡胶塞封口，再经过冷冻为固态-抽真空-解冻三次循环 后，加入DMF溶解的10. 55mg硫酸铜，室温搅拌反应24h，用去离子水透析3天（透析袋 3500MWC0)，冰冻法得产物，产率75. 60 %。
[0030] PMPC-Dns胶束对Sec的检测
[0031] 胶束制备
[0032] PEG-b-poly(MPC)和PMPC-Dns的胶束通过透析法制备。取25.Omg共聚物溶解在 四氢呋喃中，搅拌下缓慢加入IOmL去离子水。室温搅拌2h，制得胶束，然后用去离子水透析 24h除去DMF(MffC01000 Da)，再加去离子水调节最终聚合物浓度为0. 5mgmLi。
[0033] 临界胶束浓度的测定（CMC)
[0034] MPC聚合物和PMPC-Dns两亲聚合物的临界胶束浓度（CMC)是以尼罗红（NR)作 为探针分子通过染料增溶法来测定的。用微量调节注射器将溶在THF中的尼罗红（0.Img mL\ 30yL)注入一个小玻璃瓶中，蒸干THF，再加入2mL的胶束溶液，搅拌5h，胶束溶液的 浓度为〇? 1~5X104mgmLi。在550nm的激发波长下进行荧光检测，得到570nm到750nm 的发射波。
[0035] 细胞毒性的检测
[0036] 胶束对作为模型的海拉细胞的细胞毒性的评估使用了标准的细胞活性检测法即