充分混合后，在4°C下静置1小 时。
[0084] 接着再在10, 000巧m下离屯、20分钟，并将上清液抽除。然后再悬浮于PBS中，并 于12,OOOrpm下离屯、10分钟，W去除残留的细菌碎片。
[0085] W上所述是用于制备隧菌体的其中一个实施例。此实施例仅供例举说明，而非用 W限制本发明的范围。本领域技术人员应明了可能进行各种修改和变化。
[008引实施例7 :使用ELISA平盘进行筛选
[0087] 将化ISA平盘（Nunc)的每孔涂覆1yg/100y1抗原（例如重组人类颗粒溶解素）。 该抗原涂覆是在4°C下、在PBS(抑7.4)中进行。然后，将各孔WPBS清洗S次，并W每孔 300y1PBS-5%脱脂牛奶，在37°C下进行封阻1. 5小时。随后WPBS清洗S次。
[008引接着，将100 y 1存在5%MPBS中的101哇10I2隧菌体或5%MPBS加入，随后添 加1-710 X化S标志。将溶液置于37°C下反应90分钟，将测试溶液丢弃，再W BS-0. 05% Tween20(PBST)清洗S次。
[0089] 每孔加入lOOulPBS。置于37°C下解化60分钟，再WPBST清洗S次，和WPBS清 洗一次。将过量的PBS从平盘晃出，并将100y1lOOmMS乙胺灯EA)加入已稀释的隧菌体， 在37°C下持续旋转30分钟。将Tris缓冲液（50y1，1M，pH7. 4)加入已稀释的100y1隧 菌体中，进行快速中和反应。
[0090] 取10ml对数生长期的TG1培养物，并加入150y1已稀释的隧菌体。将100y1的 TG1培养物也加入免疫平盘中，将该两组培养物于37°C下静置培养30分钟进行感染。将上 述10ml和100y1已感染的TG1细菌汇集，并于400化pm下离屯、15分钟。将离屯、下来的细 菌再悬浮于2xTY中，并平布于大2YTAG平板上。使细菌于30°C下生长过夜。
[00川实施例8 :使用Dynabeads@平盘进行筛选
[009引 将晦na:b:eads@W1mlPBS预洗；次，并再悬浮于2 %MPBS中。将隧菌体（0. 3nd) 与0.5ml2%PBSM、和上述已清洗的Dynabeads?混合。将所生成的悬浮液置于旋转器上 进行预培养30分钟。
[0093] 取出Dynabeads'?并加入颗粒溶解素。将所生成的混合物在旋转器上进行混合90 分钟。将Dynabeads?WlmlPBS预洗立次，并再悬浮于2%MPBS中。然后将此混合物在 旋转器上进行反应90分钟。
[0094] 将隧菌体颗粒溶解素混合物加至已平衡的Dynabeads@，在旋转器上再反应30 分钟。接着将Dynabeads@Wlml0. 05%PBST、0. 2%PBSM和PBS进行清洗。然后将已结 合的隧菌体W1ml的lOOmMTEA稀释。于反应期间，预先备妥含有0. 5ml1MTris，pH7. 4 的试管，W便加入已稀释的隧菌体中进行快速中和。
[009引取6ml对数生长期的TG1培养物，并加入经TEA稀释的隧菌体。亦将4ml的TG1 培养物加入上述珠粒中。将该两组培养物于37°C(水浴）下静置培养30分钟。
[0096] 将上述已感染的TG1细菌汇集，并于4000巧m下离屯、15分钟。将离屯、下来的细菌 再悬浮于2xTY中，并平布于大2YTAG平板上。使细菌于30°C下生长过夜。
[0097] 实施例9 :制备次一回合的隧菌体
[0098] 将5-6ml的2xYT、15%甘油加至上述已经生长过夜的细菌平板，并使用玻璃涂布 棒使菌落松脱。将50-100 刮下的细菌加至100ml2巧TAG中。将细菌在37°C下伴随摇 晃生长直到600nm下的0D值达到0. 5。将10ml此培养物加入比例为1:20的M13K07辅助 隧菌体进行感染。将已感染的培养物在37°C(水浴）中静置培养30分钟。
[0099] 将已感染的细胞于4000rpm下离屯、15分钟收集细菌。将离屯、下来的细菌溫和地 再悬浮于50ml2巧TAK中，并将该培养物于30°C下伴随摇晃进行培养过夜。
[0100] 取40ml上述隔夜培养物并在10,OOOrpm下离屯、20分钟，收集上清液。将1/5体 积（8ml)的PEG/化C1加入该上清液中。充分混合并将其于4°C下静置1小时或W上。于 10, 00化pm下离屯、20分钟，然后将上清液抽除。将离屯、下来的细菌再悬浮于2mlPBS中，并 于12,OOOrpm下离屯、10分钟，W去除大部分残留的细菌碎片。
[0101] 实施例10 ELISA筛检阳性隧菌体
[0102] 从上述平板挑出个别菌落接种于200iil2巧TAG96孔平盘中，并在37°C下伴随 摇晃进行培养过夜。使用96孔转移装置将接种物从此平盘移入第二个每孔含有200y1 2xTYAG的96平盘中。使其在37°C下，伴随摇晃生长2小时。将50y1含有109p化的M13K07 辅助隧菌体的2XYTAG加入上述第二平盘的各孔中。在37°C下静置30分钟，然后在37°C下 摇晃1小时。
[0103] 于4000巧m下离屯、30分钟，然后将上清液抽除。将离屯、下来的细菌再悬浮于 300 yl2巧TAK中。在30°C下摇晃生长过夜。在4000巧m下离屯、30分钟，并将lOOyl该 培养物上清液用于隧菌体化ISA。
[0104] 将化ISA平盘W1yg/100y1每孔的蛋白抗原进行涂覆。将各孔WPBS清洗S次， 并W每孔300y1 2%MPBS于37°C下进行封阻2小时。将各孔WPBS清洗S次。将100y1 上述的隧菌体培养物上清液加入。在37°C下反应90分钟。将测试溶液丢弃，并WPBST清 洗S次。将适当稀释于2%MPBS的HRP-抗-M13抗体加入。于37°C下反应90分钟，再W PBST清洗=次。
[0105]W受质溶液灯MB)呈色。添加50y1 1M硫酸W终止反应。颜色应转变成黄色。在 650皿的450皿下读取0D值。从0D450值减去0D650值。
[010引从Dynabeads?和ELISA平盘方法所得的亲和性汰选结果，列示于图7。由图7所 示的序列（括号中是表示其相对应的SEQIDNO编号）显示，就个别的重链或轻链CDR而 言，其序列具有高度保守性。本领域技术人员应明了，含有一中或多种运类CDR序列或同源 序列的抗体（或其片段）可预期能与该抗原（例如颗粒溶解素）结合。因此，根据本发明 的实施方案，抗颗粒溶解素抗体可W包括一或多种运类CDR序列或同源序列。根据本发明 的实施方案，同源序列相对于该标祀序列，可W包括50%、60%、70%、80%、90%或更高的 序列同一性。
[0107]根据本发明的实施方案，已例举性鉴定得19株特别纯系。下表列示代表运类19 纯株的重链（VH)和轻链（VL)可变区的DNA与蛋白质序列的SEQID编号。其特定序列请 参见说明书的序列表。
[010 引
[0109]
[0110] 上述实施例是例举说明，抗颗粒溶解素抗体的选殖和筛检，W和各别可变区（与 重链或轻链CDRs)的特性分析。本领域技术人员应了解，重链和/或轻链序列与CDRs可 用于制造全长抗体或抗体片段（例如，scFv、F油、F(油)2等）。此外，本领域技术人员应了 解，本说明书所掲露的特定序列仅供说明，在不偏离本发明范围的前提下，可能从运类序列 产生各种变异。例如，本领域技术人员应了解，CDR区是与抗体结合的重要区域，而骨架区 为结构支架。因此，本领域技术人员可针对骨架区和不影响抗体结合的某些残基进行修饰。
[0111] 实施例11 :颗粒溶解素对于细菌的细胞毒性
[0112] 可利用任何感受性细胞或细菌，进行颗粒溶解素细胞毒性测试。例如，可使用绿脈 杆菌进行该项分析。
[0113] 在一项例举性分析中，将绿脈杆菌培养过夜，并通过在5000rpm下离屯、5分钟收集 细菌。将细胞WlOmM憐酸盐缓冲液清洗，并WlOmM憐酸盐缓冲液稀释300倍。将45y1 该细菌溶液加入各含有5y1颗粒溶解素（例如，起始浓度为0. 748yg/5y1)和1y1抗体 (例如，从原始浓度开始，进行5X稀释）的测试混合物中。颗粒溶解素可W是由大肠杆菌 表达制得的，且分子量可为9kDa或15kDa(参见图1)。
[0114] 将混合物37°C下伴随旋转反应3小时。然后将细菌平铺于LB平板上，若需要则加 W稀释（例如进行1XU0X和100X稀释），并培养过夜。分析方法W流程图方式列于图 8。
[0115] 简述之，将=组平盘培养过夜：一为仅含有细菌的对照组，一为含有颗粒溶解素 (0. 5yg)与相同数量细菌的溶解组，和一个含有相同数量细菌、颗粒溶解素（0.5yg)与测 试抗体（可增加多组平盘而W不同浓度（例如〇.4yg和2.0yg)进行测试）的抗体组。如 图8的流程图所示，颗粒溶解素预期可将细菌溶解，而产生少许菌落。在添加能够抗衡颗粒 溶解素作用的抗体后，可预期细菌会受到保护，而使菌落数回复到与对照组相似的数量。
[0116] 分析结果列示于图9和图10。如图9所示，所有测试抗体皆显示在保护细菌不被 15kDa颗粒溶解素（0. 5yg)溶解上具有非常好的功效。甚至W0. 4yg抗体剂量，所有抗体 皆有效。随着剂量增加（2. 0yg抗体），大部分抗体可完全抑制由颗粒溶解素造成的溶解作 用。
[0117] 图10显示使用9kDa颗粒溶解素取代15kDa颗粒溶解素进行类似测试的结果。 于图10所示的结果大部分是与图9的结果相似，惟有四种抗体（#3123、#422F、#422M和 RF-10)未显示具有可感受的保护活性。此四种抗体在Wl5kDa颗粒溶解素进行测试时， 显示在对抗颗粒溶解素诱导的溶解作用上具有良好活性。活性上的差异极有可能是因为， N-端片段是存在于15kDa颗粒溶解素，而非9kDa颗粒溶解素中（参见图1)。因此，运类测 试显示此四种抗体对应的抗原决定基是位于，不存在于9kDa颗粒溶解素的N-端片段内。同 样推论，其他八种抗体巧4209、#3131、#4256、#4279、#3141、#2292、#4227 和 #3319)对应的 抗原决定基是位于，共同存在于9kDa与15kDa颗粒溶解素的区域内。
[0118] 基于颗粒溶解素的抗微生物（溶解）活性进行的溶解分析所得的结果与上述使用 角质细胞进行分析所得的结果（图5) -致，可确认运类抗体能够中和颗粒溶解素的溶解活 性。运类结果表示，运类抗体可用于预防由颗粒溶解素介导的病症，例如SJS、TEN和GV皿。
[0119] 实施例12 :亲和力测量和动力学分析
[0120] 对于使用作为治疗剂，抗体应较佳地对于目标分子（例如颗粒溶解素）具有良好 的亲和力。可使用任何适当仪器（例如，于BIAcoreT100进行的SPR-为基础的分析），来 分析各种抗体与颗粒溶解素结合的亲和力和动力学。例如，通过使用相关联软件进行的多 循环动力学（MCK)方法，来测量和分析结合动力学。
[0121] 作为本发明的一个实施例，将颗粒溶解素固定于忍片上，其密度是可使RmJi到 50 - 150反应单位（RU)的范围内。
[0122] 在本实施例中，动力学分析参数如下：数据收集速率IHz;双侦测模式；溫度： 25°C;浓度单位：nM;和缓冲液A皿S-EP。五次重复测量。各种仪器设定如下所示。
[0123] 分析物样本参数如下：类型：多循环动力学，接触时间：420s，流速：10yL/min，流 动路径：双向，安定化时间：90s。
[0124] 再生参数如下：再生溶液：25mM甘氨酸抑1. 5,接触时间：90s，流速：30yL/min， 流动路径：双向。
[01巧]启动周期参数如下：类型：低样本耗损，接触时间：420s，解离时间：600s，流速： 30yL/min，流动路径：双向。
[0126] 将抗颗粒溶解素抗体W电泳缓冲液进行系列稀释。所得的系列浓度为40、20、10、 5、2. 5、1. 25、0. 625、0. 3125、0 和 0. 125nM(重复组）。
[0127]WBIAcoreTlOO分析软件评估结果。将结合反应数据减去空白流动槽所得的数 据，W校正来自缓冲液的影响。使用1:1朗缪尔曲线拟合模式估算k。或k。。（结合速率或开 启速率），和kd或kwf(解离速率或关闭速率）。或者，可从稳态结合形式浓度（即，图11所 示曲线中的平线区），作为W类似于酵素动